用于微量呼吸道合胞病毒分型检测的引物及其应用制造技术

本发明专利技术涉及一种用于微量呼吸道合胞病毒(HRSV)分型检测的引物、试剂盒和检测方法。所述引物包括巢式PCR扩增引物和测序引物，巢式PCR扩增引物包括A,B通用的外侧引物和内侧A、B型特异性引物，用该引物组可以实现对微量HRSV的基因分型。本发明专利技术所述试剂盒在通用的外侧引物中加入了简并碱基，提高了扩增的范围，通过该引物建立的分型方法可快速准确的区分病毒载量不高的HRSV的型别，并有效地节约了成本，能够达到快速、准确筛查的效果，为HRSV的早期诊断提供科学依据。诊断提供科学依据。诊断提供科学依据。

【技术实现步骤摘要】
用于微量呼吸道合胞病毒分型检测的引物及其应用


[0001]本专利技术属病毒核酸的检测
，具体涉及对呼吸道合胞病毒RNA进行微量检测的引物、试剂盒及检测方法，灵敏度高，准确性好，符合临床应用的标准。

技术介绍

[0002]呼吸道合胞病毒最早于1955年由美国沃尔特
·
里德陆军研究所在患有呼吸道疾病的黑猩猩体内发现，后来于1957年由chanock和FinbergⅢ从儿童体内分离出来，并命名为人呼吸道合胞病毒(human respiratory syncytial virus,HRSV)。
[0003]HRSV属于肺炎病毒科，有包膜，是非节段性、单股负链RNA病毒，主要导致急性下呼吸道感染，常见症状为咳嗽、咯痰、喘憋和发热及呼吸音异常，严重者会出现哮喘综合征、呼吸道阻塞、肺不张甚至窒息死亡，个别患儿会出现皮疹、弥漫性红斑等并发症。据报道，HRSV是世界范围内婴幼儿下呼吸道感染最重要的病原体之一，而且主要发生于5岁以下的儿童。近年来，有研究发现HRSV也是老年人、成年人、免疫缺陷者下呼吸道感染的常见病毒。
[0004]HRSV流行有明显的季节性，流行模式不易预测。在中国，HRSV的流行季节主要为南方的夏秋季和北方的冬春季，流行高峰南方主要在7、8月，北方主要在12月至次年3月，且呈A、B亚型交替流行。目前国际上通常依据G蛋白第二黏蛋白区的第二高变区核苷酸序列对HRSV进行基因分型，利用系统进化树进行同源关系分析A、B亚型以及进行基因型分组。
[0005]HRSV在全世界范围都出现过暴发流行，可导致儿童、成年人、老年人以及免疫缺陷患者产生严重下呼吸道感染及较高的死亡率，是WHO公认的公共卫生问题。目前HRSV致病机制尚不完善，且临床尚无有效疫苗，进一步加大了HRSV治疗与预防的困难性。除此之外，HRSV流行有明显的季节性，流行模式不易预测。再者随着HRSV多种新基因型相继出现，并呈现交替流行以及共流行的现象，基因型的不断变异、变迁，所造成的疾病程度也有所不同，所引起的临床认识也需进一步拓展。因此，建立快速、灵敏、特异且成本低的HRSV检测方法亟不可待，这对HRSV的早期诊断，进一步及时制定个性化治疗方案，以及预防和控制具有非常重要的意义。

技术实现思路

[0006]本专利技术的目的在于提供一种呼吸道合胞病毒RNA进行微量检测的引物、试剂盒及检测方法，该专利技术所涉及的检测方法操作方便安全，灵敏度高，成本低，检测效率高，可在快速检测微量呼吸道合胞病毒中广泛应用。
[0007]一种用于微量呼吸道合胞病毒(HRSV)分型检测的引物，包括A,B通用的外侧引物和内侧A、B型特异性引物；其中，A,B通用的外侧引物核苷酸序列分别是SEQ ID NO1和SEQ ID NO2所示；内侧A型特异性引物的核苷酸序列分别是SEQ ID NO3和SEQ ID NO4所示；内侧B型特异性引物的核苷酸序列分别是SEQ ID NO5和SEQ ID NO6所示。
[0008]OUT
‑
F：TTWYCAYTTTGAAGTGTTCAAYT(SEQ ID NO1)
[0009]OUT
‑
R：ACACTGGTATACCAACCAGTT(SEQ ID NO2)
[0010]INA
‑
F：CAAACCTCAAACCACTAAATCA(SEQ ID NO3)
[0011]INA
‑
R：ACACTGGTATACCAACCAGTT(SEQ ID NO4)
[0012]INB
‑
F：TCCCTGTAGTATATGTGGTAAT(SEQ ID NO5)
[0013]INB
‑
R：ACACTGGTATACCAACCAGT(SEQ ID NO6)
[0014]其中，A,B通用的外侧引物核苷酸序列加入了简并碱基，W表示碱基A或T，Y表示碱基C或T。
[0015]进一步地，A,B通用的外侧引物和内侧A、B型特异性引物的反向引物序列是相同的。
[0016]进一步地，所述A,B通用外侧引物、内侧A型特异性引物和内侧B型特异性引物的每对引物中的正、反向引物上分别带有测序引物的正、反向引物，测序引物的核苷酸序列如SEQ ID NO7和SEQ ID NO8所示。
[0017]M13
‑
F：TGTAAAACGACGGCCAGT(SEQ ID NO:7)
[0018]M13
‑
R：AACAGCTATGACCATG(SEQ ID NO:8)
[0019]本专利技术还提供了一种用于微量呼吸道合胞病毒(HRSV)分型检测的试剂盒，包括以上所有引物。
[0020]进一步地，还包括PCR反应预混液，第一轮PCR与第二轮PCR反应预混液的体系不同，第一轮PCR反应体系为20ul，第二轮PCR反应体系为50ul。
[0021]一种用于微量呼吸道合胞病毒(HRSV)分型检测的方法，包括以下步骤：
[0022](1)提取病毒RNA；
[0023](2)逆转录病毒RNA为cDNA；
[0024](3)所述的A,B通用的外侧引物配制PCR反应液，并加入第(2)步中的cDNA模板进行第一轮扩增；
[0025](4)所述的内侧A、B型特异性引物分别配制PCR反应液，并加入第(3)步中的PCR产物进行第二轮扩增；
[0026](5)琼脂糖凝胶电泳对第(4)步的PCR产物进行检测；
[0027](6)所述的测序引物对步骤(4)的PCR产物进行测序。
[0028]进一步的，步骤(5)或步骤(6)为可选择的步骤。例如可以只采用步骤(5)的电泳法对扩增产物进行判断，也可以只采用步骤(6)的测序法对扩增产物进行判断；或者同时采用步骤(5)的电泳法和步骤(6)的测序法对检测结果进行判断。
[0029]进一步地，所述步骤(7)中的测序序列利用软件BioEdit及MEGA4都可以进行HRSV型别判别。
[0030]进一步地，病毒核酸样本的来源可以是咽拭子，鼻拭子或其他能够提取到病毒核酸的任何样本。
[0031]进一步地，所述步骤(3)和步骤(4)中的PCR反应的退火温度不同，步骤(3)的退火温度是50℃，步骤(4)的退火温度是55℃。
[0032]进一步地，所述步骤(7)中的测序序列利用软件BioEdit及MEGA4都可以进行HRSV型别判别。
[0033]基于上述技术，本专利技术的有益效果为：
[0034]本专利技术基于对呼吸道合胞病毒的序列分析，设计用于HRSV基因分型的引物，特异
性好，扩增效果好，在引物中加入了简并碱基，扩大了扩增范围，而且扩增得到的产物片段大小合适，且能够清晰地体现出HRSV的基因分型。
[0035]本专利技术所用巢式PCR克服了单纯PCR反应对模板浓度的高要求，用本专利技术所述引物和巢式PCR方法可以实现微量样本的可靠，准确，低成本的检测要本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种用于微量呼吸道合胞病毒(HRSV)分型检测的引物，其特征在于，包括A,B通用的外侧引物和内侧A、B型特异性引物；其中，A,B通用的外侧引物的核苷酸序列为SEQ ID NO1和SEQ ID NO2；内侧A型特异性引物的核苷酸序列为SEQ ID NO3和SEQ ID NO4；内侧B型特异性引物的核苷酸序列为SEQ ID NO5和SEQ ID NO6，SEQ ID NO1：OUT
‑
F
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TTWYCAYTTTGAAGTGTTCAAYTSEQ ID NO2：R
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ACACTGGTATACCAACCAGTTSEQ ID NO3：INA
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F
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CAAACCTCAAACCACTAAATCASEQ ID NO4：R
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ACACTGGTATACCAACCAGTTSEQ ID NO5：INB
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F
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TCCCTGTAGTATATGTGGTAATSEQ ID NO6：R
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ACACTGGTATACCAACCAGT。2.根据权利要求1所说的引物，其特征在于，W表示碱基A或T，Y表示碱基C或T。3.一种用于微量呼吸道合胞病毒(HRSV)分型检测的引物，包括A,B通用外侧引物、内侧A型特异性引物和内侧B型特异性引物，其特征在于，在A,B通用的外侧引物中加入了简并碱基，W表示碱基A或T，Y表示碱基C或T。4.根据权利要求3所述的引物，其特征在于...

【专利技术属性】
技术研发人员：王淑一，董春燕，
申请(专利权)人：长沙艾迪康医学检验实验室有限公司，
类型：发明
国别省市：