电化学检测外泌体的方法技术

一种电化学检测外泌体的方法，包括CRISPR

【技术实现步骤摘要】
电化学检测外泌体的方法


[0001]本专利技术涉及一种细胞来源物质的检测方法方法，特别涉及一种电化学方法，对来自于如：干细胞的生物物质实施定性和定量的检测。

技术介绍

[0002]间充质干细胞通过旁分泌机制分泌的30～150nm的微囊泡，能够借助所携带的蛋白质，microRNAs等生物活性物质拥有介导间充质干细胞的治疗效力，在多种疾病的治疗中发挥作用。外泌体分离后进行有效鉴定是开展后续的研究或临床应用的前提与基础。相关研究表明，间充质干细胞可以用于在神经系统损伤疾病的治疗，其次，外泌体可被修饰来加载分子药物，且具有较少不良反应和免疫原性，并能在长久的储存过程中维持活性。然而，间充质干细胞源性外泌体治疗在临床应用过程中依然面临着许多挑战。因此，建立一种高效灵敏的间充质干细胞外泌体的检测定量方法显得尤为重要。
[0003]目前已有的检测方法为蛋白免疫印迹，纳米粒子追踪分析以及酶联免疫吸附试验等，这些方法过程较为繁琐复杂，纳米粒子追踪分析需要以不同稀释度对样品进行多次测量且不能检测生物化学成分，酶联免疫吸附试验只能分析个别水平的外泌体，而不能进行大量分析。

技术实现思路

[0004]本专利技术的一个目的在于提供一种电化学检测外泌体的方法，简化检测过程。
[0005]本专利技术的另一个目的在于提供一种电化学检测外泌体的方法，利于对间充质干细胞外泌体实施高通量检测，提高外泌体的分析量。
[0006]本专利技术的再一个目的在于提供一种电化学检测外泌体的方法，提高间充质干细胞外泌体的检测灵敏度。
[0007]本专利技术的又一个目的在于提供一种电化学检测外泌体的方法，实现间充质干细胞外泌体的定量检测。
[0008]规律成簇的间隔短回文重复(CRISPR)和其相关的Cas蛋白构成一个整合的CRISPR
‑
Cas系统。CRISPR
‑
Cas系统利用特定的RNA激活Cas蛋白并启动外源核酸的选择性切割，目前已被广泛用于基因编辑和分子诊断。其中，Cas12a蛋白不仅能切割双链DNA，而且还能够不加选择地切割单链DNA，且具有极高的酶转换率，在分子诊断中具有出色的灵敏度和特异性。
[0009]一种电化学检测间充质干细胞的方法，包括CRISPR
‑
Cas12促进的级联信号放大反应和引物置换反应，对外泌体实施电化学检测。
[0010]另一种电化学检测外泌体的方法，包括两条DNA链，即P链和H链，其中P链是一条能够发生延伸反应的短引物链，H链是引物置换反应的模板发夹链；P链能够以H链为模板在聚合酶的作用下发生延伸。
[0011]P链的核酸序列为：5'
‑
TTATACCGAGTA
‑
3'；
[0012]H链的核酸序列为：5'
‑
TCTCCACATCATAGGGTTTTCCCTATGATGTGGAGATACTCGGTATAA
‑
3'，在其3
’
末端进行胆固醇修饰。
[0013]另一种电化学检测间充质干细胞的方法，包括crRNA和5
’
末端由亚甲基蓝标记的DNA，以实施CRISPR
‑
Cas12a辅助的信号放大。
[0014]crRNA的核酸序列为：5'
‑
UAAUUUCUACUAAGUGUAGAUUAUGAUGUGGAGAUACUCCC
‑
3'。
[0015]5’
末端由亚甲基蓝标记的DNA的核酸序列为：5'
‑
TACCGAATTCCCCTACCTACCCTGCGCACTTCC
‑
3'。
[0016]为了实施本专利技术电化学检测外泌体的方法，采用CB[7]/AuNP/PDDA功能化的石墨电极为工作电极，铂丝为辅助电极，饱和甘汞电极为参比电极进行电化学检测，电化学扫描范围为振幅为25mV，频率为15Hz。
[0017]为了实施本专利技术电化学检测外泌体的方法，还包括采用免疫磁珠捕获外泌体，比如：采用CD63抗体功能化的免疫磁珠，通过氨基
‑
羧基反应制备得到CD63抗体功能化的免疫磁珠。
[0018]经验证，本专利技术的方法在外泌体浓度范围为103颗粒/mL至10
10
颗粒/mL与得到的电化学信号呈线性相关，能在此浓度范围内实现定量化的电化学检测。检测外泌体的检测限为708颗粒/mL，显著优于现有的绝大多数外泌体检测方法。
[0019]本专利技术技术方案实现的有益效果：
[0020]本专利技术将CRISPR
‑
Cas12a系统引入外泌体的检测分析，结合引物置换反应建立了一种经济有效且具有高灵敏度外泌体定量分析新方法。引物置换反应与基于Cas12a蛋白反式切割活性的反应相结合，有效地提高了该方法的检测灵敏度。
[0021]本专利技术通过级联信号放大策略的信号放大具有效率高，速度快的特点，因而实施本专利技术提供的方法能显著提高检测速度、提高样本的检测数量、以及检测范围广等优势。
附图说明
[0022]图1为检测外泌体技术方案的路线图；
[0023]图2为捕获外泌体结果图；
[0024]图3为加入不同DNA的核酸反应的聚丙烯酰胺凝胶电泳结果图；
[0025]图4为外泌体的电化学响应对比图；
[0026]图5为不同浓度外泌体的电化学信号响应结果线性拟合图。
具体实施方式
[0027]以下结合附图详细描述本专利技术的技术方案。本专利技术实施例仅用以说明本专利技术的技术方案而非限制，尽管参照较佳实施例对本专利技术进行了详细说明，本领域的普通技术人员应当理解，可以对专利技术的技术方案进行修改或者等同替换，而不脱离本专利技术技术方案的精神和范围，其均应涵盖在本专利技术的权利要求范围中。
[0028]图1为检测外泌体技术方案的路线图。具体方法包括：
[0029](1)设计两条DNA链，即DNA链P和DNA链H，其中DNA链P是一条能够发生延伸反应的短引物链，DNA链H是引物置换反应的模板发夹链；DNA链P能够以DNA链H为模板在聚合酶的作用下发生延伸。
[0030](2)工作电极采用葫芦[7]脲(CB[7])、金纳米颗粒(AuNPs)和聚二烯丙基二甲基氯化铵(PDDA)逐层功能化的石墨电极。电极经过砂纸打磨和铝粉抛光后先后在水和乙醇中超声波洗涤。为了在电极表面上形成带正电荷的PDDA膜，将电极浸入PDDA溶液中，随后，AuNPs通过与PDDA膜的静电相互作用吸附到电极表面。最后，将电极与CB[7]在室温下孵育并用蒸馏水彻底洗涤，得到CB[7]/AuNP/PDDA功能化的石墨电极。
[0031](3)当检测体系中存在间充质干细胞外泌体时，外泌体能够被CD63抗体修饰的免疫磁珠捕获，胆固醇修饰的H链可以通过胆固醇和外泌体膜磷脂之间的疏水作用插入外泌体膜，磁性分离后，未插入外泌体膜的核酸探针被除去，此时，若向溶液中加入引物P链本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种电化学检测外泌体的方法，其特征在于包括CRISPR
‑
Cas12促进的级联信号放大反应和引物置换反应，对间充质干细胞外泌体实施电化学检测。2.根据权利要求1所述的电化学检测外泌体的方法，其特征在于包括两条DNA链，即P链和H链；所述P的核酸序列为：5'
‑
TTATACCGAGTA
‑
3'；所述H链的核酸序列为：5'
‑
TCTCCACATCATAGGGTTTTCCCTATGATGTGGAGATACTCGGTATAA
‑
3'，在其3
’
末端具有胆固醇修饰。3.根据权利要求1所述的电化学检测外泌体的方法，其特征在于以crRNA和5
’
末端由亚甲基蓝标记的DNA实施CRISPR
‑
Cas12促进的级联信号放大反应；所述crRNA的核酸序列为：5'
‑
UAAUUUCUACUAAGUGUAGAUUAUGAUGUGGAGAUACUCCC
‑
3'；...

【专利技术属性】
技术研发人员：章毅，伍婷，赵婧，胡肖希，陈亮，
申请(专利权)人：中国干细胞集团上海生物科技有限公司中国干细胞集团海南博鳌附属干细胞医院有限公司重庆市干细胞技术有限公司上海市干细胞技术有限公司陕西省干细胞技术有限公司苏州市干细胞技术有限公司三亚市干细胞技术有限公司，
类型：发明
国别省市：