多孔葡甘露聚糖支架和生产该支架的方法技术

本发明专利技术提供了生产具有均匀孔隙率和互连度的葡甘露聚糖支架的方法。通过将葡甘露聚糖凝胶保持在指定条件下以满足固化阶段的时间长度来制备所述支架。该方法在减少制造废料的同时改进产物一致性。所得葡甘露聚糖支架能够促进细胞生长并适用于三维组织培养和工程学。促进细胞生长并适用于三维组织培养和工程学。促进细胞生长并适用于三维组织培养和工程学。

【技术实现步骤摘要】
【国外来华专利技术】多孔葡甘露聚糖支架和生产该支架的方法
[0001]相关申请的交叉引用本申请要求2019年10月29日提交的美国临时申请号62/927,207的优先权，其通过引用以其整体并入本文。
[0002]专利技术背景组织工程学需要功能细胞、适当的生化因子和生物材料支架以再生、改善、替换或修复受损、患病或缺失的组织和/或器官，以努力改善患者的临床结果。组织工程学也可用于开发生物构建体（construct）以研究和筛选毒素、药物、蛋白质和各种化合物。尽管细胞是用于生成组织和生物构建体的基本结构单元，但生物材料支架在体内或体外建立有益于构建组织的环境中起到关键作用。
[0003]支架可由天然来源材料（例如基于碳水化合物或蛋白质的生物材料）或合成材料（例如基于聚合物或陶瓷的材料）构建。支架材料应该是生物相容的和生物可降解的，并且其应该具有与相关组织/部位一致的机械性质。支架架构还应表现出足够的孔径和密度以允许细胞和营养物的扩散（O
’
Brien Materials Today 2011 14:88
‑
95）。
[0004]已用作组织工程学支架的碳水化合物基生物材料包括但不限于藻酸盐、壳聚糖、糖胺聚糖和杂化复合材料。葡甘露聚糖（GM）聚合物是超高交联的，以产生有益于生物应用的高度多孔、热稳定、生物相容和生物可降解的结构。
[0005]基于碳水化合物的支架也已用作骨诱导因子，如重组人BMP
‑
2的载体媒介物（vehicle）。rhBMP
‑
2已用于超适应症颈前路椎间盘切除融合术（ACDF），但所用浓度远超过天然存在的BMP
‑
2水平以补偿超出植入部位向邻近组织中的泄漏。这样的泄漏和高剂量与不良事件相关联。因此，有效地将BMP
‑
2定位在植入部位并降低有效剂量的载体是合意的。
[0006]当前生产葡甘露聚糖支架的方法导致结构坍塌和不均匀孔隙率。这一观察结果尚未得到研究，并且迄今还没有采取任何努力以防止结构坍塌或不均匀孔隙率。相反，简单地选择支架构建体的具有适当结构和孔隙率的部分，并将其与其余部分切离以提供用于组织工程学的最佳结构。支架构建体的未选择的不合适的部分被丢弃，导致相当大的废料量和总生产成本的增加。此外，设备和实验室的不规则性导致结构坍塌和不均匀的孔隙率。设备变化（由于冷冻机的机龄、制造、型号或配置）、位置变化（由于凝胶在冷冻机内的高度或深度）、运行变化（由于功率波动或中断）和用户变化（由于打开/进入冷冻机）都导致甚至单个冷冻系统内的温度差异。
[0007]因此，改进支架特性的方法是必要的。美国专利号9,359,591中公开的制造多孔葡甘露聚糖支架的方法导致葡甘露聚糖支架的结构坍塌。本专利技术提供了获得葡甘露聚糖支架的结构特性的更好结果的改进方法。
[0008]专利技术概述已经发现，通过控制固化阶段的时间长度变量，可制造均匀多孔和互连的支架。在一个实施方案中，本专利技术提供了一种制备葡甘露聚糖支架的方法，其包括在导致约10
‑
2000分钟或在一些实施方案中50
‑
1500分钟的固化阶段的条件下冷冻葡甘露聚糖凝胶。该方法可包括监测凝胶的温度。
[0009]在另一实施方案中，本专利技术提供了一种制备葡甘露聚糖支架的方法，其包括步骤：a) 将葡甘露聚糖凝胶从约25℃的温度冷却到约4℃的温度；b) 将葡甘露聚糖凝胶在固化阶段保持至少约10分钟；c) 将葡甘露聚糖凝胶解冻至约25℃的温度；d) 任选地重复步骤a)、b)和/或c)。在一些实施方案中，该制备方法包括至少1、2、3或4个冻融循环。
[0010]本专利技术还提供由本文所述的制造方法制成的支架。
[0011]在另一实施方案中，本专利技术提供一种支架，其具有至少约50%的孔隙率和/或至少约50%的互连度（interconnectivity）。在一个实施方案中，孔隙率和/或互连度均匀地呈现在整个支架中。在另一实施方案中，具有所述孔隙率和/或互连度特性的支架的体积是葡甘露聚糖凝胶的体积的至少10%。在一个实施方案中，所述支架具有约100
‑
500 μm的均匀孔径。
[0012]在一个实施方案中，本专利技术的方法包括中和支架的pH的步骤。类似地，在一个实施方案中，本专利技术提供具有约7的pH的支架。
[0013]本专利技术的支架具有至少50% w/w碳水化合物混合物的骨架，和在一些实施方案中至少50%葡甘露聚糖的骨架。所述骨架可包含复合材料。在一些实施方案中，所述支架包括一种或多种骨成分（如钙和磷酸盐）和/或一种或多种形态发生蛋白（如BMP
‑
2）。
[0014]在另一实施方案中，所述支架是射线可透的。
[0015]在另一实施方案中，所述支架可用于实验建模以及治疗应用。这样的实验和治疗用途包括但不限于新血管形成、矫形外科、心血管、神经元、伤口愈合、止血、药物筛选和药物递送、组织再生、类器官（organoid）、组织（包括软组织）和骨（再）生成、皮肤病学和牙科学。
[0016]附图简述图1A显示使用现有技术制成的葡甘露聚糖支架。其表现出结构的显著坍塌，导致不均匀的孔隙率。图1B显示使用所述的本方法制成的GM支架。
[0017]图2显示葡甘露聚糖（GM）体系的阶段图。GM体系的温度沿y轴表示，且时间沿x轴表示。GM凝胶首先经历温度变化，直至达到冷冻（冷却）温度，随后是恒温期，我们将其定义为固化阶段的时间长度（LTSP）。当凝胶达到低于冰点的温度时，可发生过冷。SP是其中凝胶中的所有液体冷冻形成冰晶的阶段。然后温度进一步冷却以达到该体系的最终温度。
[0018]图3显示具有互连孔隙的高度多孔葡甘露聚糖支架。图3显示将葡甘露聚糖支架浸没在有色染料中。图3B显示染料通过互连孔隙渗透支架。图3C显示完全被染料饱和的支架。
[0019]图4显示通过间接检测得出的rhBMP
‑
2在HCCP中保留的时间进程。将HCCP支架在BMP
‑
2溶液中培养5分钟（负载），然后洗涤30分钟、16、40和64小时。经由ELISA测量溶液中残留rhBMP
‑
2的浓度（黑条）。通过从基线（虚线）储液浓度减去rhBMP
‑
2的累积残留浓度，计算支架对rhBMP
‑
2的保留。误差条代表平均值的标准误差（N = 5次重复实验）。
[0020]图5显示HCCP对rhBMP
‑
2的保留的间接检测。将HCCP支架置于rhBMP
‑
2溶液中并培养30分钟。rhBMP
‑
2残留（黑条）代表在用HCCP培养后溶液中剩余rhBMP
‑
2的浓度。基线对照是没有在HCCP存在下培养的rhBMP
‑
2储液；PBS用作阴性对照（误差条代表平均值的标准误差；N = 在ELISA检测中的12次重复技术）。灰色条代表通过从平均“基线”浓度减去平均“残留”而计算出本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
【国外来华专利技术】1.一种制备葡甘露聚糖支架的方法，所述方法包括冷冻葡甘露聚糖凝胶，其中冷冻条件导致约10
‑
2000分钟的固化阶段以产生葡甘露聚糖支架。2.根据权利要求1所述的方法，其进一步包括监测所述葡甘露聚糖凝胶的温度。3.根据权利要求1所述的方法，其中所述固化阶段为约50
‑
1500分钟。4.根据权利要求1所述的方法，其进一步包括至少一个冻融循环。5.根据权利要求4所述的方法，其包括2至4个冻融循环。6.根据权利要求1
‑
5中任一项所述的方法，其中所述葡甘露聚糖支架包括表现出约100
‑
500 μm的均匀孔径的多孔部分。7.根据权利要求1
‑
5中任一项所述的方法，其中所述葡甘露聚糖支架具有至少约50%的孔隙率和至少约50%的互连度。8.根据权利要求7所述的方法，其中所述具有至少约50%的孔隙率和至少约50%的互连度的葡甘露聚糖支架的体积为所述葡甘露聚糖凝胶的体积的至少约10%。9.根据权利要求1所述的方法，其进一步包括将所述葡甘露聚糖支架中和至约7的pH。10.根据权利要求1所述的方法，其进一步包括使所述葡甘露聚糖支架与细胞培养基和...

【专利技术属性】
技术研发人员：C，
申请(专利权)人：安纳摩利斯有限责任公司，
类型：发明
国别省市：