通过粒子复合物的离散计数进行分析物检测和量化制造技术

本文中描述了用于离散检测和量化样品中的目标分析物的系统和方法，所述系统和方法基于目标分析物结合到两个以上粒子以形成分析物连接的粒子复合物。根据所用粒子的独特物理特性，相对于未结合的单体粒子，能够区分和计数所述分析物连接的粒子复合物。在本发明专利技术的一些实施方案中，这可能涉及一种类型的目标分析物，而在其他实施方案中，它可能单独地或以分析物复合物的方式涉及多种不同类型的目标分析物。析物。析物。

【技术实现步骤摘要】
【国外来华专利技术】通过粒子复合物的离散计数进行分析物检测和量化


[0001]本专利技术整体涉及分析和量化生物学分析物的
，更具体地，涉及提供改进的准确性和灵敏度、更大的动态范围和简化的工作流程的系统和方法。

技术介绍

[0002]高灵敏度分析测量是现代科学和医学的基础。蛋白质和其他小粒子测量对于生物医学研究和医学诊断也很重要。然而，大多数生物医学测定缺乏准确测量单一分析物的灵敏度和精度，特别是在复杂的样品基质中。大多数蛋白质和小粒子测定都围绕批量分析设计，并且通常需要信号放大。尽管批量分析能够并且确实提供了关于整个系统的有用信息，但它们通常总是具有根本性限制，这些限制阻碍了它们识别和量化分析物或分析物亚群的多种特征的能力。对于诸如血清、尿液或唾液的复杂样品来说，这个问题尤其明显，其中目标蛋白质和其他分析物的浓度极低，并且许多非目标分析物的浓度比目标分析物高出几个数量级，而且数据或诊断读数的精度和准确性至关重要。
[0003]用于量化特定蛋白质的最常用的生物医学测定包括酶联免疫吸附测定(ELISA)、蛋白质印迹法和质谱法。ELISA的功能是用涂布在板或微珠表面的特异性抗体捕获目标分析物，然后用特异性二次酶缀合抗体来标记分析物，以使得随后的信号放大(通常是色素沉着、发光或荧光)，从而在浓度范围内检测抗体
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分析物夹心物。通常，ELISA仅提供有限的动态范围，需要大量的样品纯化和洗涤，产生必须与校准曲线大致相当的模拟数据，并且由于如下原因而不可避免地产生变化的结果：孵育时间的微小变化、试剂质量的批次间的差异、由于洗涤和不同浓度下结合平衡的变化而引起的分析物或抗体的损失、诸如温度或光照的实验条件的细微差异、产生信号所需的许多底物和缓冲液组分的浓度的精度以及甚至各种测定组分在储存中稳定性随时间的差异。在大多数情况下，ELISA的检测下限(LOD)在pM范围内，而据说，大多数相关的生物医学分析物以aM至fM的范围存在于血清中，并且它们在尿液和唾液中可能低几个数量级。将多个步骤的孵育时间分别提高到>10小时，明显增加捕获表面积和/或使用荧光或放射性同位素标记的底物已被证明有可能将LOD降低到仄摩(zeptomolar)(zM)范围。然而，这对于诊断分析而言不是实用的工作流程，特别是对于即时护理类型的环境或有许多患者样品和/或时间至关重要的任何情况。
[0004]诸如蛋白质印迹法和质谱法的方法更多用于定性，但可以通过将信号强度与参考标准相关联以试图量化。在某些情况下，这就足够了，特别是在尚未开发出更多量化方法的情况下，但它不是用于诊断目的的精确方法。尽管ELISA已针对更精确的分析量化进行了微调，但这些方法实际上对于ELISA的开发和优化至关重要。
[0005]用于单一分析物量化的最新技术发展是数字ELISA。该方法利用特定比例的足以捕获在珠子的亚级分上的单目标分析物的抗体涂布的微珠，然后类似于传统的ELISA，用酶缀合检测抗体标记目标分析物。与传统ELISA的不同之处以及使测定成为数字化的原因在于，最佳捕获至多1个蛋白质的单个珠子然后散布到50K孔至200K孔的阵列(称为单分子阵列)的单独的飞升(fL)级的孔中，并在暴露于酶底物后通过荧光和光学显微镜离散地进行
计数。因为珠子被捕获在fL级的孔中，所以包围各个单独的珠子的体积足够小，使得即使是极低浓度的检测酶也能产生酶促信号，从而增加到能够区分阳性孔和阴性孔的程度。将荧光孔中的各个珠子指定为有活性的，并且活性珠子的百分比是相对于通过光学显微镜所确定的总珠子数计算的。
[0006]专利技术名称为“用于目标分析物检测和溶液中目标分析物浓度测定的方法和阵列”(Methods and Arrays for Target Analyte Detection and Determination of Target Analyte Concentration in Solution)的专利合作条约(PCT)专利申请WO 2007/098148 A2公开了单分子阵列和产生限定体积为10阿升至50皮升的单分子阵列的方法。所公开的方法能够检测和量化诸如酶的生物分子的单分子，以用于发现功能、检测结合配偶体或抑制剂和/或测量速率常数。可以清楚地区分0对1个以上蛋白质的数字计数通过降低传统ELISA的噪声屏障而大大增强了蛋白质检测的灵敏度。不幸的是，数字ELISA中有限数量的微孔限制了测定的动态范围。此外，必须仔细平衡测定中的酶浓度，以尽量减少背景噪声并防止信号饱和。
[0007]所有基于ELISA的方法的一个主要问题是，为了产生一致的标记，必须提供超过目标分析物浓度的试剂。出于该原因，必须在每个标记步骤以后使用洗涤工序，以除去过量且无处不在的未结合试剂，从而最大限度地减少对最终测量结果的干扰。洗涤步骤不仅消耗时间和资源，而且它们还改变了结合试剂与游离试剂之间所建立的平衡，这可能导致标记的分析物的偏差和损失。此外，酶促扩增可能由于多种原因而导致不同的信号输出，这些原因包括酶动力学的差异、非特异性活性、精确试剂的质量或数量、批次间的变化以及与时间相关的功能丧失。
[0008]因此，本领域需要改进的分析物量化，以具有提高的准确性和灵敏度、更大的动态范围和简化的工作流程。

技术实现思路

[0009]本专利技术提供了改善生物学分析物的分析和量化的系统和方法，所述系统和方法具有改进的准确性和灵敏度、更大的动态范围和简化的工作流程。
[0010]在本专利技术的主要实施方案中，提出了用于在单一分析物水平上检测并计数样品中的一种类型的目标分析物的系统和方法。所述系统由如下两组不同的粒子构成：捕获粒子和检测粒子。所述捕获粒子与分析物特异性试剂缀合，所述分析物特异性试剂对目标分析物的特定结合位点或表位具有特异性亲和力。检测粒子与另一种分析物特异性试剂缀合，所述另一种分析物特异性试剂对同一目标分析物的第二结合位点或表位具有特异性亲和力。当将含有目标分析物的样品与捕获粒子和检测粒子混合时，可以形成分析物连接的粒子复合物。如果样品混合物中目标分析物的浓度明显低于捕获粒子和检测粒子的浓度，则复合物主要是粒子双联体，所述粒子双联体由通过单个目标分析物连接到单个检测粒子的单个捕获粒子构成。通过以能够离散检测、区分和计数分析物连接的粒子双联体相对于非分析物结合的(下文中称为未结合的)单体粒子的方式分析样品混合物，可以准确确定样品中目标分析物的浓度。
[0011]在较高的目标分析物浓度下，可能会形成含有多种分析物的更高阶的粒子复合物。通过以能够离散检测、区分和计数所有分析物连接的粒子多联体相对于未结合的单体
粒子的方式分析样品混合物，可以再次准确地确定样品中目标分析物的浓度。
[0012]应注意，本专利技术中讨论的试剂的分析物特异性不应按字面意思理解。本专利技术中的捕获粒子可以与试剂集合C缀合，并且检测粒子与另一试剂集合D缀合，其中C的一部分靶向一组分析物A，而D的一部分靶向A或A的亚组。此处还应注意，C和D可以相同，或部分重叠，或完全不同。
[0013]在本专利技术的前本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
【国外来华专利技术】1.一种用于同时检测和量化生物学分析物的系统，所述系统在混合在一起时形成粒子复合物，所述系统包含至少一个子系统，其中所述子系统包括：a.一组目标分析物，其中各个目标分析物选自：i.具有多个结合位点的单组份；和ii.多组分，各个组分包括至少一个结合位点；b.一组捕获粒子，各个捕获粒子能够结合到所选目标分析物的第一结合位点；和c.一组检测粒子，各个检测粒子能够结合到所选目标分析物的第二结合位点，所述第二结合位点不同于所述所选目标分析物的所述第一结合位点。2.根据权利要求1所述的系统，其中所述捕获粒子和/或检测粒子被标记有独特的物理特性。3.根据权利要求2所述的系统，其中能够形成包含捕获粒子和检测粒子的粒子复合物，所述捕获粒子和检测粒子通过一种或多种它们相应的目标分析物连接在一起。4.根据权利要求3所述的系统，其中，在各个子系统中，能够离散地区分和计数所述分析物连接的粒子复合物和未结合的粒子。5.根据权利要求4所述的系统，其中目标分析物是指其化学性质或生物学性质正被识别和/或测量的任何物质；并且，其中粒子是指能够将若干物理性质、化学性质和/或生物学性质如直径、电荷和/或材料组成归因于其的任何小的局部对象。6.根据权利要求4所述的系统，其中所述目标分析物可以与这样的试剂结合，该试剂共价缀合至或使用亲和标签缀合至捕获粒子或检测粒子。7.根据权利要求6所述的系统，其中所述试剂可以是特异性或非特异性结合至所述目标分析物的位点的任何物质，该试剂包括但不限于：抗体、结合蛋白质、肽、多肽、蛋白质复合物、糖、寡糖、多糖、DNA、RNA、寡核苷酸、多核苷酸、核苷酸复合物、单链核酸序列、双链核酸序列、适体、天然聚合物、合成聚合物、药品、药物、脂质、去污剂、胶束、脂质体、脂蛋白、细胞外囊泡、外泌体、原癌小体、病毒、病毒样粒子、细胞、细胞碎片和化学品。8.根据权利要求6所述的系统，其中所述亲和标签是指这样的任何分子或实体，该分子或实体对第二分子或结合配偶体具有亲和力或能够被所述第二分子或结合配偶体识别且更普遍地靶向，并且当与组分对差异性缀合时能被用于将两种组分如试剂和粒子一起带入到复合物中，所述亲和标签包括但不限于：生物素、链霉亲和素、亲和素、中性亲和素、血凝素、聚组氨酸、麦芽糖结合蛋白、myc、谷胱甘肽
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转移酶、FLAG、蛋白质A、蛋白质G、蛋白质L、DNA、RNA、寡核苷酸、多核苷酸、单链核酸序列、双链核酸序列、物种特异性抗体、类别特异性抗体和同种型特异性抗体。9.根据权利要求4所述的系统，其中粒子可因所述结合配偶体之间的缀合物理性质、化学性质和/或生物学性质直接结合到分析物，所述性质包括但不限于：形状、电荷、化学键合和/或生物学亲和力。10.根据权利要求4所述的系统，其中在某些子系统中所述检测粒子可以用分子探针代替。11.根据权利要求10所述的系统，其中在含有分子探针的子系统中所述分析物的浓度根据在被标记捕获粒子上的分析物连接的分子探针的平均数量来测量。12.根据权利要求4所述的系统，其中，在某些子系统中，可以引入调节剂以调节、抑制
或增强分析物与偶联试剂之间或分析物复合物各组分之间的结合亲和力。13.根据权利要求4所述的系统，其中所述子系统彼此区分，并且各个子系统内各种分析物连接的粒子复合物和未结合的粒子全部同时通过任何方法被离散地检测、区分和计数。14.根据权利要求4所述的系统，其中所述子系统彼此区分，并且各个子系统内各种分析物连接的粒子复合物和未结合的粒子全部同时通过它们的光、电子、电磁、荧光、放射性同位素、化学、质量、尺寸、亲和力、材料组成和/或密度特征以及这些特征的逻辑组合被离散地检测、区分和计数。15.根据权利要求4所述的系统，其中所述子系统彼此区分，并且各个子系统内各种分析物连接的粒子复合物和未结合的粒子全部同时使用多参数粒子计数器如流式细胞仪或成像或激光扫描显微镜被离散地检测、区分和计数。16.根据权利要求4所述的系统，其中从单一子系统的离散检测、区分和计数获得的数据用于确定所述分析物浓度。17.根据权利要求4所述的系统，其中从多个不同的子系统的离散检测、区分和计数获得...

【专利技术属性】
技术研发人员：陈永勤，乔治，
申请(专利权)人：君诺贝生物技术公司，
类型：发明
国别省市：