本发明专利技术公开了一种高危型人乳头瘤病毒核酸检测试剂盒，所述试剂盒包括13种高危型HPV的通用引物、高危型HPV16/18型的引物和FAM荧光探针序列。应用该发明专利技术，可以对未知样本中的高危型人乳头瘤核酸DNA进行检测。该发明专利技术使用了通用引物减少了引物用量和体系的复杂性，并且能达到现有技术的精密度，降低了成本提高了检测效率。检测效率。检测效率。
【技术实现步骤摘要】
一种高危型人乳头瘤病毒核酸检测试剂盒
[0001]本专利技术涉及临床体外检测
，具体涉及一种高危型人乳头瘤病毒核酸检测试剂盒。
技术介绍
[0002]HPV病毒是人类乳头瘤病毒的缩写，主要感染区域有人类表皮和黏膜鳞状上皮，至今已经分离出130多种，至少有85种已经进行完全测序。HPV是乳多空病毒科的乳头瘤空泡病毒A属，是一个7200～8000bp左右的双链环状DNA病毒，基因组编码三个功能区，即早期转录区、晚期转录区和上游调控区。
[0003]临床上一些学者根据HPV致癌危险性的大小将其分为高危型和低危型。低危型HPV主要引起肛门皮肤和外生殖器疣类病变，其亚型主要包括HPV6、11、30、39、42、43和44型；高危型HPV包括16、18、31、33、35、39、45、51、52、53、56、58、59、66和68型，主要引起宫颈癌、外阴癌、肛门癌等。最近的研究资料表明，引起宫颈癌的原因是多种多样的，但是与HPV的感染关系密切。尤其是高危型HPV感染是宫颈癌和癌前变病发的重要条件，而高危型中以16/18最为常见，其中超过2/3的宫颈癌和其感染有关系。HPV分型还与宫颈癌病理类型有关，HPV16与宫颈癌关系最为密切，HPV18最易导致宫颈腺癌。HPV16/18感染是宫颈癌高危因素，能客观反映宫颈癌的恶化程度，HPV型也可以反映癌组织的病理学类型，可以作为评估患者预后的新指标。
[0004]现有技术对HPV病毒的体外检测试剂盒领域，大部分属于单一种类的病毒检测，费时费力：或者是添加多种引物的检测，加大了检测成本。
技术实现思路
[0005]本专利技术提供了一种高危型人乳头瘤病毒核酸检测试剂盒。本专利技术通过设计HPV31、33、35、39、45、51、52、53、56、58、59、66和68型总共13种高危型HPV病毒的通用引体，并且针对性的加入了HPV16型和HPV18型的引体，可以有效的判断待检样本是否为高危型人乳头瘤病毒。
[0006]为实现上述目的，本专利技术的一种高危型人乳头瘤病毒核酸检测试剂盒是通过以下技术方案实现的：
[0007]本专利技术包括核酸释放剂、PCR混合液、酶混合液、HPV阳性对照和HPV阴性对照；所述PCR混合液中包括13种高危型HPV的通用引物、内标、FAM荧光探针、HPV16的引物与HPV18的引物；
[0008]所述13种高危型HPV的通用引物分为上游引物HPV
‑
F与下游引物EB
‑
R：
[0009]所述上游引物HPV
‑
F序列：
[0010]5'TGCCTGGGGCAATCAGTTATTTGTTAC3'；
[0011]所述下游引物EB
‑
R序列：
[0012]5'CCTCTGCCATGACTAACCTATTCCTTAA3'；
[0013]所述HPV16的引物分为上游引物与下游引物：
[0014]所述HPV16的上游引物序列：
[0015]5'TCATTTTATAATCCAGATACACAGCG3'；
[0016]所述HPV16的下游引物序列：
[0017]5'ATAAAGGATGGCCACTAATGCC3'；
[0018]所述HPV18的引物分为上游引物与下游引物：
[0019]所述HPV18的上游引物序列：
[0020]5'AGCATTTATAATCCTAAAACACAACG3'；
[0021]所述HPV18的下游引物序列：
[0022]5'AAAATGGATGCCCACTAAGGC3'；
[0023]所述内标的引物分为上游引物和下游引物：
[0024]所述内标的上游引物：
[0025]5'AATTGACCGTGGTGGTGCTC3'；
[0026]所述内标的下游引物：
[0027]5'GGAGCATCGCTGTACTAGG3'；
[0028]所述FAM荧光探针由13种高危型HPV的通用引物的FAM荧光探针、HPV16的FAM荧光探针、HPV18的FAM荧光探针和内标的FAM荧光探针组成，
[0029]所述13种高危型HPV的通用引物的FAM荧光探针序列：
[0030]5'TCAGCAACAACCCTGCCCTG3'；
[0031]所述HPV16的FAM荧光探针序列：
[0032]5'CGCAGTACAAATATGTCATTATGTGCTGCC3'；
[0033]所述HPV18的FAM荧光探针序列：
[0034]5'TTAACAATATGTGCTTCTACACAGTCTCCTGTACC3'；
[0035]所述内标的FAM荧光探针序列：
[0036]5'ACACCTAATGGCTGACC3'。
[0037]进一步的，所述核酸释放剂包括：氯化钠、chelex
‑
100和十二烷基硫酸钠；所述氯化钠的浓度为0.1～0.4M；所述chelex
‑
100的浓度为3～6％；所述十二烷基硫酸钠的浓度为2～6％。
[0038]进一步的，所述PCR混合液由PCR混合液A与PCR混合液B组成，所述PCR混合液A包括所述13种高危型HPV的通用引物、内标、13种高危型HPV的通用引物的FAM荧光探针和内标的FAM荧光探针，还包括5～15mM的Tris
‑
HCL、2～4mM的氯化钾、2.5～5mM的氯化镁和0.1～0.2mM的dNTPs；
[0039]所述混合液B包括所述HPV16的引物、HPV18的引物、HPV16的FAM荧光探针和HPV18的FAM荧光探针，还包括5～15mM的Tris
‑
HCL、2～4mM的氯化钾、2.5～5mM的氯化镁和0.1～0.2mM的dNTPs。
[0040]进一步的，所述13种高危型HPV的通用引物、内标的引物、HPV16的引物与HPV18的引物的总体积为0.2～0.4μM，所述13种高危型HPV的通用引物、内标的引物、HPV16的引物与HPV18的引物的体积相等。
[0041]进一步的，所述FAM荧光探针的体积为0.5～1μM，所述13种高危型HPV的通用引物
的FAM荧光探针、HPV16的FAM荧光探针、HPV18的FAM荧光探针和内标的FAM荧光探针的体积相等。
[0042]进一步的，所述酶混合液包括4～8U的Taq酶和0.3～0.8U的UNG酶。
[0043]进一步的，所述试剂盒的反应体系为95℃，3min；94℃，15s；64℃，31s；一共40个循环。
[0044]与现有技术相比，本专利技术具有以下有益效果：
[0045]本专利技术通过设计HPV31、33、35、39、45、51、52、53、56、58、59、66和68型总共13种高危型HPV病毒的通用引物，并且针对性的加入了HPV16型和HPV18型的引物，使用了通用本文档来自技高网...
【技术保护点】
【技术特征摘要】
1.一种高危型人乳头瘤病毒核酸检测试剂盒，其特征在于，包括核酸释放剂、PCR混合液、酶混合液、HPV阳性对照和HPV阴性对照；所述PCR混合液中包括13种高危型HPV的通用引物、内标、FAM荧光探针、HPV16的引物与HPV18的引物；所述13种高危型HPV的通用引物分为上游引物HPV
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F与下游引物EB
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R：所述上游引物HPV
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F序列：5'TGCCTGGGGCAATCAGTTATTTGTTAC 3'；所述下游引物EB
‑
R序列：5'CCTCTGCCATGACTAACCTATTCCTTAA 3'；所述HPV16的引物分为上游引物与下游引物：所述HPV16的上游引物序列：5'TCATTTTATAATCCAGATACACAGCG3'；所述HPV16的下游引物序列：5'ATAAAGGATGGCCACTAATGCC3'；所述HPV18的引物分为上游引物与下游引物：所述HPV18的上游引物序列：5'AGCATTTATAATCCTAAAACACAACG3'；所述HPV18的下游引物序列：5'AAAATGGATGCCCACTAAGGC3'；所述内标的引物分为上游引物和下游引物：所述内标的上游引物：5'AATTGACCGTGGTGGTGCTC3'；所述内标的下游引物：5'GGAGCATCGCTGTACTAGG3'；所述FAM荧光探针由13种高危型HPV的通用引物的FAM荧光探针、HPV16的FAM荧光探针、HPV18的FAM荧光探针和内标的FAM荧光探针组成，所述13种高危型HPV的通用引物的FAM荧光探针序列：5'TCAGCAACAACCCTGCCCTG 3'；所述HPV16的FAM荧光探针序列：5'CGCAGTACAAATATGTCATTATGTGCTGCC3'；所述HPV18的FAM荧光探针序列：5'TTAACAATATGTGCTTCTACACAGTCTCCTGTACC3'；所述内标的FAM荧光探针序列：5'ACACCTAATGGCTGACC3'。2.根据权利要求1...
【专利技术属性】
技术研发人员：李林林，胡晓飞，谢清华，董雯，
申请(专利权)人：山东博弘基因科技有限公司，
类型：发明
国别省市：
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