一种植物在体体细胞杂交的方法技术

本发明专利技术涉及一种植物在体体细胞杂交的方法，所述方法包括：选择期望获得的植物类型的优良品种的雌性器官和繁殖单位的体细胞团作为杂交母本受体，授精前处理去除生殖隔离，使之易于受精，选择具有期望获得的品种的性状的动物或植物、微生物等生物的个体、器官、组织、细胞、染色体或染色体片段、DNA或DNA片段和基因作为父本供体，加入体细胞杂交剂搅匀，获得授精液，在体细胞杂交剂的介导下用授精液给受体授精，受精胚取回后进行胚挽救并培养成苗。本发明专利技术突破远缘杂交瓶颈，能够培育高产优质品种，具有广泛的应用前景。具有广泛的应用前景。

【技术实现步骤摘要】
一种植物在体体细胞杂交的方法


[0001]本专利技术属于植物改良领域。具体涉及一种植物在体体细胞杂交的方法。

技术介绍

[0002]虽然早在1972年，植物离体体细胞杂交就已成功，然而由于体细胞杂交在室内进行，受体数量受到极大限制，更重要的是，由于离开了母体，导致杂交阳性率太低，供后代选择优良个体的群体太小，育成优良品种的概率太低，因而至今鲜有大面积应用于生产的体细胞杂交育成品种。而在体体细胞杂交则可弥补上述居多不足之处。然而在本专利技术前，未见有关在体体细胞杂交成功的报道。因而目前有性杂交仍然是最常用的植物改良方法。
[0003]然而，由于有性杂交不仅要求父母本均为有母本是显花植物，而且需要父本的精子。这就不仅使数量及其巨大的微生物不能用于授精，而由于精子获取要么十分困难，要么价格昂贵，大量以动物为父本的杂交受到极大限制，而微生物和动物具有植物所没有又亟需的数量巨大的极其优良的性状。因而，体细胞杂交具有极其重要的植物改良价值。然而，在本专利技术前，同样未见植物和微生物，植物和动物体细胞杂交成功的报道。
[0004]在体体细胞杂交之所以难以成功，对于植物来说主要是因为植物性器官和体细胞表面存在生殖隔离物质—识别蛋白，即糖蛋白，它就像一把锁，把供体的遗传物质拒之门外。
[0005]然而现代科学研究表明，不同生物种类间虽然外形相去甚远，却存在相同基因序列(毛黎，不同植物种类存在相同基因序列，科技日报，2012年4月11日，第1版)。所以，只要父母本染色体相遇，无论亲缘关系远近，均可以配对或部分配对，即使不能配对，还可以加倍染色体。因此，父母本染色体不能同处一隅，是亲缘关系远的物种间杂交不孕的根本原因。而远缘杂交父母本染色体之所以不能同处一隅，是由于植物柱头和花粉/精子存在识别蛋白，即糖蛋白，细胞上存在细胞膜(动物)或同时存在细胞膜和细胞壁(植物)，它们就像一把锁，把远缘花粉/精子拒之门外。所以只要降解受体和供体外层的糖蛋白，就能使远缘供体的遗传物质靠近受体染色体等遗传物质，使亲缘关系远的父母本染色体/遗传物质配对/部分配对/结合，就可获得远缘杂交种子。

技术实现思路

[0006]本专利技术的目的是克服现有技术的不足，采用有效措施突破杂交瓶颈实现在体体细胞杂交方法，彻底打破生殖隔离限制，选育期望的植物品种，甚至人工主导生物进化。
[0007]因而，本专利技术提供一种植物在体体细胞杂交的方法，其特征在于：所述方法包括下述步骤：
[0008](1)将父本供体与体细胞杂交剂混合，获得授精液；其中，选择具有期望获得的品种的性状的生物的个体、器官、组织、体细胞团、细胞、染色体或染色体片段、DNA或DNA片段和基因作为父本供体；其中，所述体细胞杂交剂的组成为：50
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300mg/L果胶酶、100
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700mg/L纤维素酶、100
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300mg/L赤霉素、10
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100mg/L生长素、1500
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5000μl/L酶解液和1500
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5000mg/
L复合氨基酸；
[0009](2)将授精液给受体授精；其中，选择期望获得的植物类型的优良品种的雌性器官或繁殖单位的体细胞团作为母本受体，授精前处理，并去除生殖隔离；
[0010](3)授精后获得的受精卵，优选地对受精卵进行胚挽救并培养成苗；
[0011]进一步地，还包括下述步骤：
[0012](4)对所获得的苗进行染色体加倍，随后移植至土壤，鉴别并去除假杂种，获得杂交种植株。
[0013]在优选实施方式中，第(1)步中所述父本供体生物的个体、器官、组织、体细胞团、细胞,其通过打浆获得授精浆液，再与体细胞杂交剂混合；所述父本供体为生物的染色体或染色体片段、DNA或DNA片段，其直接与体细胞杂交剂混合。
[0014]在优选实施方式中，第(2)步中所述对母本受体进行授精前处理，是在精子成熟前去除雌雄同体植物的雄性器官、或者基本无性繁殖单位生长点外部的覆盖层；更具体地，对大型孢子植物，在精子成熟前去雄，授精前剪去子房等雌性器官外层覆盖物，如花萼、花瓣等，并短截柱头、子房壁、珠被、果皮、种皮等子房内层覆盖物，使子房裸露；对于受体为雌雄异株种子植物和可杂交繁殖的大型孢子植物雌株，授精前剪去子房等雌性器官外层覆盖物，如花萼、花瓣等，并短截柱头、子房壁、珠被、果皮、种皮等子房内层覆盖物，使子房裸露；对于受体为无性繁殖植物和大型孢子繁殖孢子植物以及有必要进行体细胞杂交的种子植物的植株、器官、组织和细胞团等繁殖单位，选择生长最旺盛处作为受精部位，如生长点等，去除其外部的覆盖层，如叶片、叶鞘和皮层等，使之裸露；对于受体为小型孢子植物，如苔藓、微藻、小型真菌和细菌等时，将受体洗净后放入打浆机内转动30秒，造成伤口。
[0015]在具体实施方式中，所述去生殖隔离的方法为，授精前向受体受精部位滴入1至数滴酶解液，使之湿透；所述酶解液是动物糖蛋白酶解法完全糖基分解酶解。
[0016]在优选实施方式中，所述体细胞杂交剂的成分为：100
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200mg/L果胶酶、300
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500mg/L纤维素酶、150
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250mg/L赤霉素、40
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70mg/L生长素、2500
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4000μl/L酶解液和2500
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4000mg/L复合氨基酸；优选地，所述酶解液为动物糖蛋白酶解法完全糖基分解酶解液。
[0017]在优选实施方式中，所述第(2)步用父本供体给受体授精的方法为：当受体为雌性器官或繁殖单位的体细胞团时，按植物品种间有性杂交方法进行；优选地，先往子房或经授精前处理的无性繁殖受体受精部位滴1至数滴浓度为1500
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5000μl/L的酶解液，使之湿透，然后用涂上准备好的授精液，最后套袋隔离，进一步优选，如此连续授精6
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12天，每天1次，直至成功受精；所述酶解液是动物糖蛋白酶解法完全糖基分解酶解液。其中所述酶解液用于降解识别蛋白—糖蛋白，因而使在体体细胞杂交成为可能。
[0018]在优选实施方式中，所述第(3)步授精后获得的受精卵进行胚挽救并培养成苗，具体是用MS培养基对受精卵进行胚挽救。
[0019]在优选实施方式中，所述第(4)步中对所获得的苗进行染色体加倍是采用秋水仙碱进行的。
[0020]在优选实施方式中，所述第(4)步中所述鉴别假杂种的方法选自以下三种中的一种或多种:
[0021]1)通过形态鉴别去除与母本接近的假杂种；2)通过成分鉴别去除与母本接近的个体；3)通过遗传鉴别去除与母本接近的个体。
[0022]在一个具体实施实施方式中，进一步包括:(5)采用广泛靶向代谢组技术检测所述品种个体代谢物的方法辅助提纯复壮，其中繁殖所述品种的方法为，在田间初选和室内复选具有所述品种典型性状个体的基础上，用广泛靶向代谢组技术检测决选杂交母本没有而父本有的特有代谢物的个体用本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种植物在体体细胞杂交的方法，其特征在于：所述方法包括下述步骤：(1)将父本供体与体细胞杂交剂混合，获得授精液；其中，选择具有期望获得的品种的性状的生物的个体、器官、组织、体细胞团、细胞、染色体或染色体片段、DNA或DNA片段和基因作为父本供体；其中，所述体细胞杂交剂的组成为：50
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300mg/L果胶酶、100
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700mg/L纤维素酶、100
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300mg/L赤霉素、10
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100mg/L生长素、1500
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5000μl/L酶解液和1500
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5000mg/L复合氨基酸；(2)将授精液给受体授精；其中，选择期望获得的植物类型的优良品种的雌性器官或繁殖单位的体细胞团作为母本受体，授精前处理，并去除生殖隔离；(3)授精后获得的受精卵，优选地对受精卵进行胚挽救并培养成苗；进一步地，还包括下述步骤：(4)对所获得的苗进行染色体加倍，随后移植至土壤，鉴别并去除假杂种，获得杂交种植株。2.如权利要求1所述的方法，其特征在于，第(1)步中所述父本为供体生物的个体、器官、组织、体细胞团、细胞,其通过打浆获得授精浆液，再与体细胞杂交剂混合；所述父本供体为生物的染色体或染色体片段、DNA或DNA片段，其直接与体细胞杂交剂混合。3.如权利要求1所述的方法，其特征在于，第(2)步中所述对母本受体进行授精前处理，是在精子成熟前去除雌雄同体植物的雄性器官、或者基本无性繁殖单位生长点外部的覆盖层；更具体地，对大型孢子植物，在精子成熟前去雄，授精前剪去子房等雌性器官外层覆盖物，如花萼、花瓣等，并短截柱头、子房壁、珠被、果皮、种皮等子房内层覆盖物，使子房裸露；对于受体为雌雄异株种子植物和可杂交繁殖的大型孢子植物雌株，授精前剪去子房等雌性器官外层覆盖物，如花萼、花瓣等，并短截柱头、子房壁、珠被、果皮、种皮等子房内层覆盖物，使子房裸露；对于受体为无性繁殖植物和大型孢子繁殖孢子植物以及种子植物的植株、器官、组织和细胞团等繁殖单位，选择生长最旺盛处作为受精部位，如生长点等，去除其外部的覆盖层，如叶片、叶鞘和皮层等，使之裸露；对于受体为小型孢子植物，如苔藓、微藻、小型真菌和细菌等时，将受体洗净后放入打浆机内转动30秒，造成伤口。4.如权利要求1所述的方法，其特征在于，第(2)步中所述去生殖隔离的方法为，授精前向受体受精部位滴入1至数滴酶解液，使之湿透；所述酶解液为动物糖蛋白酶解法完全糖基分解酶解液。5.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述体细胞杂交剂的成分为：100
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200mg/L果胶酶、300
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500mg...

【专利技术属性】
技术研发人员：何觉民，曾松亭，何仪，唐林华，周建伟，何蓉，
申请(专利权)人：深圳前海觉民科技有限公司，
类型：发明
国别省市：