敲除CD38基因的细胞系、其构建方法及应用技术

本发明专利技术提供一种敲除CD38基因的细胞系，其构建方法及应用。具体地，所述敲除CD38基因的细胞系是利用例如SEQ ID NO：1

【技术实现步骤摘要】
敲除CD38基因的细胞系、其构建方法及应用


[0001]本专利技术与免疫学和工程细胞等
有关。具体地，本专利技术构建了敲除CD38的细胞系，该细胞系可用于评估CD38
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CD3双特异性抗体的效价强度。

技术介绍

[0002]多发性骨髓瘤是一种常见的恶性血液肿瘤，引起广泛的骨质破坏、复发性感染、贫血、高钙血症、肾机能不全，以及一系列不良反应。多发性骨髓瘤由分泌抗体的浆细胞的致瘤性转化引起。其特征是贯穿骨髓的多病灶恶性病变。尽管遗传分析揭示了该病的复杂性和异质性，但是大部分癌细胞高表达CD38。这与正常淋巴细胞和骨髓细胞中CD38的低表达明显不同。
[0003]CD38是一个II型跨膜糖蛋白，发挥多种功能，比如，CD38作为参与启动活化和增殖信号的受体，作为粘附分子，也可作为胞外酶。由于多发性骨髓瘤浆细胞上CD38的高水平一致表达，以及CD38作为受体和胞外酶而发挥作用，CD38代表了一个用于治疗骨髓瘤的有希望的治疗靶点。CD38抗体发挥作用的机制是多效性的。治疗性CD38 mAb(Dora或者Morre)发挥依赖于Fc的免疫效应机制，例如，补体依赖性细胞毒性反应(CDC)、抗体依赖性细胞毒性反应(ADCC)、抗体依赖性细胞吞噬作用(ADCP)以及通过二级交联的凋亡。胞外酶功能的抑制和直接凋亡也可能促进抗体杀死多发性骨髓瘤细胞的效能。双特异性抗体(CD38
×
CD3)将细胞毒性T细胞向表达肿瘤相关抗原的癌细胞的招募是一种极具潜力的用于治疗恶性血液病的治疗方式。
[0004]Promega开发了一个基于细胞的T细胞活化生物检测方法，该方法利用稳定表达由NFAT应答元件(NFAT
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RE)驱动的荧光素酶报告基因的Jurkat T作为效应细胞。NFAT转录因子家族在免疫应答中发挥重要作用。内源性表达肿瘤抗原的肿瘤细胞系作为抗原提呈细胞。将这两种细胞系共培养，并添加CD3双特异性抗体(bsAb)，Jurkat效应细胞的TCR/CD3被激活。通过NFAT
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RE激活而上调荧光素酶活性。该分析特别适用于bsAb的相对效能的确定，并且呈现良好的线性关系。该分析方法也很简单且稳健。由于Jurkat T细胞也表达CD38蛋白，当利用工程改造的Jurkat报告基因细胞作为效应细胞来构建适用于CD3
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CD38双特异性抗体的报告基因分析方法时，Jurkat T细胞上表达的CD38也将刺激报告基因细胞的活化，并增加非特异性信号，从而干扰分析结果。因此，利用敲除CD38的Jurkat T来确定CD3
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CD38双特异性抗体活性是很重要的。本研究利用CRISPR
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Cas9系统来敲除Jurkat T中的CD38。
[0005]CRISPR
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cas系统稳健且多能的刺激真核细胞中靶向的双链DNA断裂(DSBs)，在DSBs处，引起的细胞修复机制非同源末端连接(NHEJ)可被用来产生易错修复。来自酿脓链球菌的Cas9核酸酶能被一种嵌合单链向导RNA(sgRNA或称为gRNA)导向任何其后有一个50
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NGG前间区序列邻近基序(PAM)的基因位点。sgRNA中的一个20nt向导序列通过Watson
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Crick碱基配对机制将Cas9导向基因组靶点，并能被轻易地设计来靶向一个预期的基因组位点。通过共表达S.pyogenes Cas9(SpCas9)核酸酶和向导RNA，CRISPR
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Cas系统能适用于
哺乳动物细胞。与以前的方法相比，CRISPR
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Cas9技术更特异并且更容易被设计来敲除基因。通过改变gRNA序列，可以靶向任何生物(从海藻到人类)的几乎任何序列。但是CRISPR
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cas9技术存在脱靶效应问题，因此如何控制脱靶效应提高技术特异性成为该技术成功应用的关键。

技术实现思路

[0006]针对以上技术问题，本专利技术公开了一种敲除CD38基因的细胞系、其制备方法及其应用，该方法能稳定敲除人急性T淋巴细胞白血病细胞Jurkat中CD38基因的表达。
[0007]具体地，本专利技术涉及以下方面：
[0008]1.gRNA，其选自SEQ ID NO：1，SEQ ID NO：2，SEQ ID NO：3，SEQ ID NO：4或SEQ ID NO：5所示的序列，或者在SEQ ID NO：1、SEQ ID NO：2、SEQ ID NO：3、SEQ ID NO：4或SEQ ID NO：5所示的序列的任5
’
末端添加或删除对应CD38基因的碱基，使得gRNA的总长度在17
‑
24个碱基范围内，或者在gRNA总长度在17
‑
24个碱基的情况下，对从3
’
端起第17位碱基上游的碱基进行置换，优选进行1个碱基的置换。
[0009]2.载体，所述载体包含项目1所述的gRNA，优选如SEQ ID NO：4所示的sgRNA；更优选地，所述载体选自质粒、慢病毒、腺病毒、或其组合，更优选cas9载体。
[0010]3.宿主细胞，其包含项目1所述的gRNA，或项目2所述的载体，优选所述宿主细胞为表达CD38的宿主细胞，更优选为Jurkat细胞，NCI
‑
H929细胞，U266B1细胞，或ARH
‑
77细胞。
[0011]4.制备敲除CD38基因的细胞系的方法，包括将项目2所述载体转染表达CD38的宿主细胞(优选Jurkat细胞，NCI
‑
H929细胞，U266B1细胞，或ARH
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77细胞)。
[0012]5.敲除CD38基因的细胞(优选Jurkat细胞，NCI
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H929细胞，U266B1细胞，或ARH
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77细胞)，其特征在于利用项目4所述的方法制备。
[0013]6.项目5所述的敲除CD38基因的细胞，其是保藏编号为CCTCC No：C2020160的人白血病T细胞系Jurkat
‑4‑3‑
F11或保藏编号为CCTCC No：C202073的人白血病T细胞系Jurkat
‑4‑3‑
D6。
[0014]7.用于评估双特异性抗体活性的改造细胞，所述双特异性抗体针对抗原A和抗原B，所述改造细胞的亲本细胞同时包含抗原A和抗原B的编码基因，所述改造细胞的特征在于敲除了亲本细胞中抗原A或抗原B的编码基因。
[0015]8.项目7所述的改造细胞，其中所述亲本细胞是Jurkat细胞、NK细胞、NCI
‑
H929细胞、U266B1细胞或ARH
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77细胞。
[0016]9.项目7或8所述的改造细胞，其中所述抗原A和抗原B选自以下各项组成的组：
[0017](1)所述抗原A为CD38抗原，所述抗原B为CD3抗原；
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【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.gRNA，其选自SEQ ID NO：1，SEQ ID NO：2，SEQ ID NO：3，SEQ ID NO：4或SEQ ID NO：5所示的序列，或者在SEQ ID NO：1、SEQ ID NO：2、SEQ ID NO：3、SEQ ID NO：4或SEQ ID NO：5所示的序列的5
’
末端添加或删除对应CD38基因的碱基，使得gRNA的总长度在17
‑
24个碱基范围内，或者在gRNA总长度在17
‑
24个碱基的情况下，对从3
’
端起第17位碱基上游的碱基进行置换，优选进行1个碱基的置换。2.载体，所述载体包含权利要求1所述的gRNA，优选如SEQ ID NO：4所示的sgRNA；更优选地，所述载体选自质粒、慢病毒、腺病毒、或其组合，更优选cas9载体。3.宿主细胞，其包含权利要求1所述的gRNA，或权利要求2所述的载体，优选所述宿主细胞为表达CD38的宿主细胞，更优选为Jurkat细胞，NCI
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H929细胞，U266B1细胞，或ARH
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77细胞。4.制备敲除CD38基因的细胞系的方法，包括将权利要求2所述载体转染表达CD38的宿主细胞(优选Jurkat细胞，NCI
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H929细胞，U266B1细胞，或ARH
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77细胞)。5.敲除CD38基因的细胞(优选Jurkat细胞，NCI
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H929细胞，U266B1细胞，或ARH
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77细胞)，其特征在于利用权利要求4所述的方法制备。6.权利要求5所述的敲除CD38基因的细胞，其是保藏编号为CCTCC No：C2020160的人白血病T细胞系Jurkat
‑4‑3‑
F11或保藏编号为CCTCC No：C202073的人白血病T细胞系Jurkat
‑4‑3‑
D6。7.用于评估双特异性抗体活性的改造细胞，所述双特异性抗体针对抗原A和抗原B，所述改造细胞的亲本细胞同时包含抗原A和抗原B的编码基因，所述改造细胞的特征在于敲除了亲本细胞中抗原A或抗原B的编码基因；优选地，其中所述亲本细胞是Jurkat细胞、...

【专利技术属性】
技术研发人员：易继祖，罗凤燕，熊晖，严永祥，周鹏飞，
申请(专利权)人：武汉友芝友生物制药股份有限公司，
类型：发明
国别省市：