本发明专利技术提供了一种基于羽扇豆过敏原Lup an1纳米抗体筛选双抗夹心纳米抗体对的方法，包括如下步骤：(1)胶体金的制备；(2)金标纳米抗体的制备；(3)采用免疫层析试纸条方法进行双抗夹心抗体对的筛选。本发明专利技术所述的基于羽扇豆过敏原Lup an1纳米抗体的使用胶体金免疫层析试纸条方法筛选双抗夹心纳米抗体对，能开发一种操作简便、耗时较短的双抗夹心检测体系中捕获抗体与检测抗体的筛选方法，用于后续食物中过敏原检测方法的构建。中过敏原检测方法的构建。中过敏原检测方法的构建。
【技术实现步骤摘要】
一种基于羽扇豆过敏原Lup an1纳米抗体筛选双抗夹心纳米抗体对的方法
[0001]本专利技术属于免疫检测领域，尤其是涉及一种基于羽扇豆过敏原Lup an1纳米抗体的采用胶体金免疫层析试纸条方法筛选双抗夹心纳米抗体对的方法。
技术介绍
[0002]传统食物过敏原组分的免疫检测技术开发基于单克隆或多克隆抗体的筛选与制备，其要求在动物免疫过程中注射高纯度过敏原蛋白，并且筛选和制备抗体周期较长。在驼源动物外周血液中天然存在一种重链抗体(Heavy Chain only Antibodies,HCAbs)，与传统单克隆抗体相比，重链抗体天然缺失轻链及重链第一恒定区(CH1)。克隆并表达重链抗体的重链可变区得到重链抗体的抗原识别和结合域，称为纳米抗体(Nanobody,Nb)。纳米抗体具有与原重链抗体相当的结构稳定性及抗原结合活性，是目前已知的可结合靶向抗原的最小抗体单位。针对传统免疫过程需要制备高纯度过敏原蛋白，并且传统单克隆抗体制备周期长，成本高，与传统单克隆抗体片段相比，纳米抗体存在诸多优势，纳米抗体制备周期短，成本低，稳定性高。纳米抗体可溶性极高，不易发生聚集沉淀，具有很高的稳定性，能够在高温、强酸、强碱等致变性条件下保持抗原结合活性，适合于原核及真核表达系统。目前，纳米抗体被广泛应用于开发治疗性抗体药物、诊断试剂(胶体金法、酶联免疫吸附法、电化学发光法)、亲和纯化基质、免疫学研究等基础科学研究领域。
技术实现思路
[0003]有鉴于此，本专利技术旨在克服现有技术中的缺陷，提出一种基于羽扇豆过敏原Lup an1纳米抗体的采用胶体金免疫层析试纸条方法筛选双抗夹心纳米抗体对的方法。
[0004]为达到上述目的，本专利技术的技术方案是这样实现的：
[0005]一种基于羽扇豆过敏原Lup an1纳米抗体筛选双抗夹心纳米抗体对的方法，包括如下步骤：
[0006](1)胶体金的制备：
[0007]采用柠檬酸三钠还原法进行胶体金纳米颗粒的制备；
[0008](2)金标纳米抗体的制备：
[0009]将羽扇豆过敏原蛋白纳米抗体标记到胶体金纳米颗粒上形成金标纳米抗体作为检测纳米抗体用于后续双抗夹心纳米抗体对的筛选；
[0010](3)采用免疫层析试纸条方法进行抗体对的筛选：
[0011]将捕获纳米抗体固定在硝酸纤维素试纸条上作为检测线，同时将HRP标记的兔抗His多克隆抗体固定在硝酸纤维素试纸条上作为质控线。将羽扇豆总蛋白样品滴加在样品垫上，使其利用膜上微孔的毛细管作用在层析条上横向泳动与检测线上的捕获纳米抗体结合，然后加入金标检测纳米抗体与羽扇豆总蛋白以及质控线上的HRP标记的兔抗His多克隆抗体结合后，形成的复合物中胶体金聚集的两条(检测线和质控线)肉眼可见的红色线条。
[0012]进一步，采用免疫层析试纸条方法筛选的捕获纳米抗体为B167，检测纳米抗体为B50。
[0013]进一步，所述的步骤(2)中的胶体金标记纳米抗体。
[0014]所述的基于羽扇豆过敏原Lup an1纳米抗体采用胶体金免疫层析试纸条方法筛选双抗夹心纳米抗体对方法的用途，所述的方法在制备检测试剂盒中的应用。
[0015]相对于现有技术，本专利技术具有以下优势：
[0016]本专利技术所述的基于羽扇豆过敏原Lup an1纳米抗体的使用胶体金免疫层析试纸条方法筛选双抗夹心纳米抗体对，能开发一种操作简便、耗时较短的双抗夹心检测体系中捕获抗体与检测抗体的筛选方法，用于后续食物中过敏原检测方法的构建。
附图说明
[0017]图1为本专利技术实施例所述的纳米抗体免疫层析试纸条筛选双抗夹心纳米抗体对显色的示意图；
[0018]图2为本专利技术实施例所述的捕获纳米抗体与金标检测纳米抗体配对选择的结果图。
具体实施方式
[0019]除有定义外，以下实施例中所用的技术术语具有与本专利技术所属领域技术人员普遍理解的相同含义。以下实施例中所用的试验试剂，如无特殊说明，均为常规生化试剂；所述实验方法，如无特殊说明，均为常规方法。
[0020]下面结合实施例来详细说明本专利技术。
[0021]一种羽扇豆过敏原Lup an1的胶体金免疫层析试纸条方法，包括如下步骤：
[0022](1)胶体金的制备
[0023]将制备胶体金所用到的三角瓶、转子等用新鲜的铬酸和双蒸水分别浸泡3天和1天。向处理好的三角瓶中(包括转子)加入足量的双蒸水，加热煮沸5min后倒掉。再向其中加入100ml双蒸水，用移液枪从中吸取出1ml双蒸水，然后加入1ml 1％的氯金酸，记录此时三角瓶中液面的高度，均匀混合后，低转速加热直至煮沸。迅速调高转速并加入1％的柠檬酸三钠。最终得到呈现为稳定的酒红色溶液，随后在加热15min后停止加热，待自动冷却至室温后，加入双蒸水使溶液体积补充至原刻度线即可。将得到的胶体金溶液放置于4℃避光保存。
[0024](2)金标纳米抗体的制备
[0025]使用移液器吸取胶体金溶液、0.2M KC2O3和纳米抗体到1.5ml进口离心管中，均匀混合后避光4℃静置反应1h。加入20％BSA溶液和10％PEG-2000溶液混合均匀后静置反应30min，用于封闭胶体金和稳定金标纳米抗体。在4℃2000rpm条件下离心15min取上清，除去未与抗体连接的胶体金。在4℃10000rpm条件下离心30min取沉淀物及所需要的金标纳米抗体。使用PBS对沉淀物进行复溶，4℃避光保存。
[0026](3)采用免疫层析试纸条方法进行抗体对的筛选
[0027]将定量的不同捕获纳米抗体固定在硝酸纤维素试纸条上作为检测线，同时将HRP标记的兔抗His多克隆抗体固定在硝酸纤维素试纸条上作为质控线。将羽扇豆总蛋白样品
滴加在样品垫上，使其利用膜上微孔的毛细管作用在层析条上横向泳动与检测线上的捕获纳米抗体结合，然后加入相对应的金标检测纳米抗体与羽扇豆总蛋白以及质控线上的HRP标记的兔抗His多克隆抗体结合后，不同的检测抗体和金标抗体两两配对形成双抗夹心结构，形成的复合物中胶体金聚集的两条(检测线和质控线)肉眼可见的红色线条，根据检测线上出现条带颜色的深浅对检测抗体和捕获抗体进行选择，结果如图2所示。
[0028]以上所述仅为本专利技术的较佳实施例而已，并不用以限制本专利技术，凡在本专利技术的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本专利技术的保护范围之内。
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【技术保护点】
【技术特征摘要】
1.一种基于羽扇豆过敏原Lup an1纳米抗体筛选双抗夹心纳米抗体对的方法，其特征在于：包括如下步骤：(1)胶体金纳米颗粒的制备：采用柠檬酸三钠还原法进行胶体金纳米颗粒的制备；(2)金标纳米抗体的制备：将羽扇豆过敏原蛋白纳米抗体标记到胶体金纳米颗粒上形成金标纳米抗体作为检测抗体用于后续双抗夹心纳米抗体对的筛选；(3)采用免疫层析试纸条方法进行双抗夹心纳米抗体对的筛选：将捕获纳米抗体固定在硝酸纤维素试纸条上作为检测线，同时将HRP标记的兔抗His多克隆抗体固定在硝酸纤维素试纸条上作为质控线；将羽扇豆总蛋白样品滴加在样品垫上，使其利用膜上微孔的毛细管作用在层析条上横向泳动与检测线上的捕获纳米抗体结合，然后加入金标检测纳...
【专利技术属性】
技术研发人员：张川，王硕，胡耀中，陆旸，
申请(专利权)人：天津科技大学，
类型：发明
国别省市：
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