海洋腹足类DNA的提取方法及其简化基因组建库方法技术

本发明专利技术属于分子生物学检测技术领域，涉及一种海洋腹足类DNA的提取方法及其简化基因组建库方法，包括取组织样清洗剪碎，加入试剂后破碎，加入酶进行消化，然后离心、过凝胶柱，经过多次过凝胶柱及离心等处理过程提取到DNA；提取的DNA进行纯化，然后依次经过引物退火、酶切反应、连接接头、PCR1、琼脂糖凝胶检测、PCR2、琼脂糖凝胶检测、样本纯化和筛选、琼脂糖凝胶检测步骤建立基因组文库。该提取方法适用于海洋腹足类DNA提取，使提取的DNA质量提升，能够满足海洋腹足类简化基因组建库的要求；并通过改进简化基因组建库的步骤，解决了现有技术中存在的海洋腹足类简化基因组建库的产量及成功率问题。功率问题。

【技术实现步骤摘要】
海洋腹足类DNA的提取方法及其简化基因组建库方法


[0001]本专利技术属于分子生物学检测
，具体涉及一种海洋腹足类DNA的提取方法及其简化基因组建库方法。

技术介绍

[0002]海洋腹足类的肌肉组织(如腹足)是提取DNA的优良部位，但其被自身分泌的富含多酚蛋白和粘多糖的黏液所包裹。海洋腹足类的生物矿化、黏附结构以及富含多酚蛋白和粘多糖的黏液会阻碍DNA提取、纯化过程，导致总DNA提取过程中经常出现总量低或者质量低的问题，对于个体比较小的物种，这种情况更为严重，如果不去除这些物质，很难得到质量较好的DNA，从而难以构建简化基因组测序文库。
[0003]现有技术中，有采用高PVP和β
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巯基乙醇提取法针对含有大量多糖和多酚类次生代谢物质的植物的DNA提取，但是由于动物和植物高质量DNA的提取存在较大差异，对于动物的DNA提取是否适用尚不可知，尤其是海洋腹足类DNA的提取更为复杂。
[0004]现有简化基因组建库技术针对海洋腹足类来讲，建库的成功率较低，且因海洋腹足类的生物矿化、黏附结构以及富含多酚蛋白和粘多糖的黏液引发问题的可能性也会大大提升，海洋腹足类简化基因组建库过程中经常出现酶切反应不完全、严重的引物二聚体等问题，常常导致建库失败或者较低的建库成功率。

技术实现思路

[0005]本专利技术的目的在于解决现有技术中存在的上述问题，提出了一种海洋腹足类DNA的提取方法及其简化基因组建库方法，该提取方法适用于海洋腹足类DNA提取，使提取的DNA质量提升，能够满足海洋腹足类简化基因组建库的要求；并改进简化基因组建库的步骤，解决了现有技术中存在的海洋腹足类简化基因组建库的产量及成功率问题。
[0006]本专利技术的技术方案是：
[0007]一种海洋腹足类DNA的提取方法，包括以下步骤：
[0008](1)向离心管中加入CTAB溶液和β
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巯基乙醇，然后取组织样清洗，加入离心管中，并剪碎，再向离心管中加入交联聚乙烯吡咯烷酮，破碎3～5次，每次粉碎时间25～35s；
[0009]上述步骤中，取海洋腹足类组织样样品，在生理盐水中充分清洗、擦干，然后剪碎，再进行后续操作；这一步骤是初步去除海洋腹足类粘液的关键一步；
[0010]CTAB溶液、β
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巯基乙醇、组织样以及交联聚乙烯吡咯烷酮(PVPP)的加入量分别是500μL CTAB、1μLβ
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巯基乙醇、20mg组织样、2mg PVPP，只有组织样和PVPP的量呈现10：1的关系才能达到较好提取效果；
[0011]而破碎步骤，可以使PVPP与多酚类物质充分结合，也有助于后续酶的消化。
[0012](2)将破碎好的离心管放入金属浴中，50～60℃下孵育7～13min，然后加入蛋白酶K和RNA酶，50～60℃下孵育3.8～4.2h，孵育期间每隔30min充分震荡一次离心管；该步骤消化至离心管中无组织样即可。
[0013](3)离心，室温冷却4～6min后，转移上清液于凝胶柱中，向凝胶柱中加入等体积预混V(苯酚):V(氯仿):V(异戊醇)＝25:24:1，颠倒混匀8～12min，然后在4℃下14000r离心8～12min；取上清液于离心管中，加入等体积的V(氯仿):V(异戊醇)＝24:1，颠倒混匀8～12min，然后在4℃下14000r离心8～12min；再次取上清液于新的离心管中，加入等体积的异丙醇，颠倒20～30次，室温孵育4～6min，在4℃下14000r离心25～35min；
[0014]步骤(3)中使用凝胶柱可以进一步去除海洋腹足类的多酚和多糖类物质。
[0015](4)弃上清液，加入75％冰乙醇混匀，4℃，14000r离心8～12min，弃上清液，加入70％冰乙醇混匀，4℃，14000r离心1.5～2.5min，再次弃上清液，开盖并放于通风处晾干17～23min，加入无RNase的水，放于4℃冰箱溶解过夜。
[0016]进一步的，所述步骤(1)中，称取的组织样在生理盐水中充分清洗后擦干，然后加入离心管中；步骤(1)中破碎次数为4次，破碎时间30s。
[0017]进一步的，所述步骤(2)中，56℃金属浴孵育10min，加入蛋白酶K和RNA酶后在56℃下孵育4h，每隔30min充分震荡一次离心管。
[0018]进一步的，所述步骤(3)具体包括：将步骤(2)得到的产物短暂离心后，将离心管室温冷却5min，转移离心管中的上清液于凝胶柱中，凝胶柱中加入等体积预混V(苯酚):V(氯仿):V(异戊醇)＝25:24:1，颠倒混匀10min，在高速冷冻离心机中，4℃，14000r离心10min，取上清液于新的离心管中，并加入等体积的V(氯仿):V(异戊醇)＝24:1，颠倒混匀10min，然后4℃，14000r离心10min，取上清液于新的离心管中，并加入等体积的异丙醇，颠倒25次，室温孵育5min，4℃，14000r离心30min。
[0019]进一步的，还包括DNA纯化步骤，即，将提取完的DNA使用全基因组纯化试剂盒进行纯化。对于某些海洋腹足类，纯化步骤至关重要，缺少这一步骤后续的简化基因建库依旧会出现酶切反应不完全、严重的引物二聚体问题。
[0020]本专利技术还提供了一种海洋腹足类DNA的简化基因组建库方法，按照上述提取方法提取到海洋腹足类DNA并进行纯化后，依次进行引物退火、酶切反应、连接接头、PCR1反应、第一次琼脂糖凝胶检测、PCR2反应、第二次琼脂糖凝胶检测、样本纯化和筛选、第三次琼脂糖凝胶检测的步骤建立基因组文库。
[0021]进一步的，PCR1反应和第一次琼脂糖凝胶检测成功后则进行PCR2反应；样品纯化和筛选步骤在PCR2反应步骤之后。这是因为PCR2之前的连接产物溶液浓度极低，若在PCR2之前进行样本的纯化和筛选会导致目的片段极少，PCR2因此会失败，而将样本的纯化和筛选放在PCR2之后，则会使得目的片段得到大量扩增。
[0022]本专利技术的有益效果：
[0023](1)本专利技术在酚
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氯仿
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异戊醇提取法的基础上进行了改良，使其能够应用到海洋腹足类的DNA提取中，提取高质量的海洋腹足类DNA，使DNA的质量提升。
[0024](2)在简化基因组建库之前添加了一步DNA的纯化步骤，这一步是整个专利技术中至关重要的一步，这一步使海洋腹足类的DNA中某些异常“顽固”的多糖类、多酚类杂质，得到进一步的去除和稀释，使得到的DNA质量得到了很好的提升，不会再出现酶切不完全、PCR产物引物二聚体等问题，进而得到满足简化基因组建库的高质量DNA，大大提高了海洋腹足类简化基因组建库的成功率；而且得到的PCR2产物质量较佳，满足测序要求。如果去掉这一步，这些海洋腹足类的DNA将无法完成后续简化基因组建库步骤。
[0025](3)本专利技术对简化基因组建库步骤及体系进行了改良：酶切步骤，调整了DNA总量达到160ng，使得加入的DNA溶液体积变大，后根本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种海洋腹足类DNA的提取方法，其特征在于，包括以下步骤：(1)向离心管中加入CTAB溶液和β
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巯基乙醇，然后取组织样清洗，加入离心管中，剪碎，再向离心管中加入交联聚乙烯吡咯烷酮，破碎3～5次，每次粉碎时间25～35s；(2)将破碎好的离心管放入金属浴中，50～60℃下孵育7～13min，然后加入蛋白酶K和RNA酶，50～60℃下孵育3.8～4.2h，孵育期间每隔30min充分震荡一次离心管；(3)离心，室温冷却4～6min后，转移上清液于凝胶柱中，向凝胶柱中加入等体积预混V(苯酚):V(氯仿):V(异戊醇)＝25:24:1，颠倒混匀8～12min，然后在4℃下14000r离心8～12min；取上清液于离心管中，加入等体积的V(氯仿):V(异戊醇)＝24:1，颠倒混匀8～12min，然后在4℃下14000r离心8～12min；再次取上清液于新的离心管中，加入等体积的异丙醇，颠倒20～30次，室温孵育4～6min，在4℃下14000r离心25～35min；(4)弃上清液，加入75％冰乙醇混匀，4℃，14000r离心8～12min，弃上清液，加入70％冰乙醇混匀，4℃，14000r离心1.5～2.5min，再次弃上清液，开盖并放于通风处晾干17～23min，加入无RNase的水，放于4℃冰箱溶解过夜。2.根据权利要求1所述的提取方法，其特征在于，所述步骤(1)中，称取的组织样在生理盐水中充分清洗后擦干，然后加入离心管中；步骤(1)中破碎次数为4次，破碎时间30s。3.根据权...

【专利技术属性】
技术研发人员：王杰，徐家伟，胡利莎，董云伟，
申请(专利权)人：中国海洋大学，
类型：发明
国别省市：