一种细胞穿膜肽-目的蛋白复合物的制备及其高效导入链霉菌活细胞的方法技术

本发明专利技术公开了一种细胞穿膜肽

【技术实现步骤摘要】
一种细胞穿膜肽
‑
目的蛋白复合物的制备及其高效导入链霉菌活细胞的方法


[0001]本专利技术涉及微生物
，具体涉及一种细胞穿膜肽
‑
目的蛋白复合物的制备及其高效导入链霉菌活细胞的方法。

技术介绍

[0002]细胞穿膜肽（Cell penetrating peptide，CPP）是一类由约5至30个氨基酸组成的短肽，其可以作为活细胞物质载运系统，通过共价或非共价偶连的方式携带目的蛋白、核酸、纳米材料等穿透动物细胞的生理屏障细胞膜，并在一定浓度内对细胞活性产生影响较小。目前，CPP已较为广泛地应用于以胞内分子为靶标的非侵入性药物递送工具。近年来的研究表明，CPP不仅能携带寡核苷酸、小干扰RNA、质粒、纳米材料等克服动物细胞细胞膜，而且能将小干扰RNA或质粒等载运至含有细胞壁结构的高等植物、藻类和微生物细胞中，但相关报道尚较为少见。
[0003]目前已有的穿膜肽介导“货物”向微生物活细胞转运的相关研究，多集中在穿膜肽可增加微生物细胞对抗菌活性物质，如抗菌肽、肽核酸和功能化光动力抗菌纳米粒子的摄取，从而起到抑菌效果增强的作用。
[0004]此外，最近几年来，科研工作者们也开始将穿膜肽应用于质粒、纳米材料的微生物细胞载运。2018年，Munish Kumar首次实现了基于Tat的衍生穿膜肽与纳米金偶联物的大肠杆菌及金黄色葡萄球菌转运。2019年，Md Monirul Islam等首次通过将含有荧光蛋白mCherry报告基因的205 kb质粒pMSR227与穿膜肽(KH)9‑
BP100非共价偶连后直接与细胞孵育的方式，成功将质粒转化到大肠杆菌DH5α细胞，并证实该方法的转化效率与电穿孔相似，并明显高于热休克法的转化效率。
[0005]综上叙述可见，穿膜肽已经开始应用于微生物细胞的外源物质活细胞载运，其具有运载多种外源物质进入微生物活细胞的应用潜力。但目前，尚未见穿膜肽介导外源蛋白进入链霉菌活细胞的相关研究及应用报道。

技术实现思路

[0006]本专利技术的目的在于提供一种可介导外源蛋白高效导入链霉菌活细胞的方法，及该方法所涉及的穿膜肽
‑
目的蛋白复合物的制备方法。利用穿膜肽向链霉菌活细胞导入目的蛋白可应用在链霉菌代谢产物检测、基因表达调控、细胞功能调控、生物防治等方面。
[0007]为实现上述目的，本专利技术采用如下技术方案：一种细胞穿膜肽
‑
目的蛋白复合物的制备方法，其特征在于：包括如下步骤：（1）构建出CPP
‑
mCherry蛋白表达质粒pET28a
‑
CPP
‑
mCherry：将穿膜肽、4个甘氨酸连接肽、荧光蛋白mCherry融合表达基因构建于大肠杆菌表达质粒pET
‑
28a(+)中；（2）将质粒pET28a
‑
CPP
‑
mCherry用氯化钙化学转化法转化入大肠杆菌E.coli BL21（DE3）感受态细胞中；
（3）将CPP
‑
mCherry重组表达菌株接种于含卡那霉素的5mL LB液体培养基中，37℃，220 rpm活化8 h，将活化菌株以1:100的体积比接种于250 mL 2
×
YT培养基中，加入250 μL卡那霉素（浓度50
‑
55 mg/mL）后培养4.5
‑
5.5 h，待OD
600
值达到0.6~0.8，将菌液降温至16℃后添加IPTG，于16℃、220 rpm诱导表达16~20 h；（4）CPP
‑
mCherry融合蛋白纯化及浓缩：将诱导表达的菌液离心后收集菌体，在菌体中加入30 mL PBS溶液，用玻璃棒将菌体从离心瓶壁剥离下来后，于涡旋仪上彻底重悬（500mL菌液所得菌体最多溶解在30mL PBS中），将重悬菌体超声破碎，然后将破碎后的菌液转入50 mL离心管中，配平后，4℃，10000 rpm离心30 min收集上清；钴亲和层析柱经PBS平衡3
‑
5个柱体积后，将收集的上清过柱，并重复挂柱一次；用PBS洗3
‑
5个柱体积，用于去除高速离心无法除去的细胞碎片等杂质；用添加含5 mM咪唑的PBS洗3
‑
5个柱体积，用于除去与凝胶非特异性结合的杂蛋白；用含150 mM咪唑的PBS洗5
‑
8个柱体积，以解离与凝胶特异性结合的目的蛋白，收集所有洗脱液；用含500 mM咪唑的PBS洗3
‑
5个柱体积，将收集的蛋白透析、浓缩，得到细胞穿膜肽
‑
目的蛋白重组融合蛋白。
[0008]（5）钴亲和层析柱复性：先用ddH2O洗6
‑
8个柱体积，然后用0.4 N NaOH洗2个柱体积，立即用ddH2O洗6
‑
8个柱体积，接着用0.1 M的EDTA洗柱，用ddH2O洗6
‑
8个柱体积后，立刻以0.1 M CoCl2洗5
‑
8个柱体积并室温孵育15 min；孵育完成以大量的ddH2O冲洗后，用PBS洗3
‑
5个柱体积平衡，于4℃可长期保存。
[0009]进一步地，步骤（1）中所述的穿膜肽及其氨基酸序列为下列一种：Tat：YGRKKRRQRRR；ANTP：RQIKIWFQNRRMKWKK；KFF3K：KFFKFFKFFK；R9：RRRRRRRRR；K9：KKKKKKKKK；KH9‑
BP100：KHKHKHKHKHKHKHKHKHKKLFKKILKYL；步骤（4）对应得到的细胞穿膜肽
‑
目的蛋白复合物为Tat
‑
mCherry、ANTP
‑
mCherry、(KFF)3K
‑
mCherry、R9‑
mCherry、K9‑
mCherry、(KH)9‑
BP100
‑
mCherry中的一种。
[0010]步骤（3）中，所述LB液体培养基中的卡那霉素浓度为50
‑
55 μg/mL，IPTG终浓度为0.1
‑
0.4 mM。
[0011]步骤（4）中，重悬菌体超声破碎时间为15 min，超声2s，停歇4s，超声过程于黑暗环境下操作。
[0012]步骤（4）中，蛋白透析、浓缩的具体步骤如下：将收集的蛋白装入透析袋，浸没在PBS溶液中，以置换蛋白收集液中的咪唑，由于目的蛋白带有荧光，因此将透析装置避光置于4℃过夜；第二天更换一次透析液；将透析后的蛋白置于蛋白浓缩管中，4℃，4000 g离心，将蛋白浓缩至1.5
‑
2 mL，浓度约为150 μM；实验操作全程避光；将所得到的蛋白于
‑
80℃避光冷冻保存。
[0013]一种高效的链霉菌活细胞外源蛋白导入方法，包括如下步骤：（1）链霉菌孢子的处理：在链霉菌平本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种细胞穿膜肽
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目的蛋白复合物的制备方法，其特征在于：包括如下步骤：(1)构建出CPP
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mCherry蛋白表达质粒pET28a
‑
CPP
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mCherry：将穿膜肽、4个甘氨酸连接肽、荧光蛋白mCherry融合表达基因构建于大肠杆菌表达质粒pET
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28a(+)中；(2)将质粒pET28a
‑
CPP
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mCherry用氯化钙化学转化法转化入大肠杆菌E.coliBL21(DE3)感受态细胞中；(3)将CPP
‑
mCherry重组表达菌株接种于含卡那霉素的5mL LB液体培养基中，37℃，220rpm活化8h，将活化菌株以1:100的体积比接种于250mL 2
×
YT培养基中，加入250μL浓度50
‑
55mg/mL的卡那霉素后培养4.5
‑
5.5h，待OD
600
值达到0.6～0.8，将菌液降温至16℃后添加IPTG，于16℃、220rpm诱导表达16～20h；(4)CPP
‑
mCherry融合蛋白纯化及浓缩：将诱导表达的菌液离心后收集菌体，在菌体中加入30mL PBS溶液，将菌体剥离下来后于涡旋仪上彻底重悬，将重悬菌体超声破碎，然后将破碎后的菌液离心、收集上清；钴亲和层析柱经PBS平衡3
‑
5个柱体积后，将收集的上清过柱，并重复挂柱一次；用PBS洗3
‑
5个柱体积，用添加含5mM咪唑的PBS洗3
‑
5个柱体积，用含150mM咪唑的PBS洗5
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8个柱体积，收集所有洗脱液；用含500mM咪唑的PBS洗3
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5个柱体积，将收集的蛋白透析、浓缩，得到细胞穿膜肽
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目的蛋白重组融合蛋白。2.根据权利要求1所述的一种细胞穿膜肽
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目的蛋白复合物的制备方法，其特征在于：步骤(1)中所述的穿膜肽及其氨基酸序列为下列一种：Tat：YGRKKRRQRRR；ANTP：RQIKIWFQNRRMKWKK；KFF3K：KFFKFFKFFK；R9：RRRRRRRRR；K9：KKKKKKKKK；KH9‑
BP100：KHKHKHKHKHKHKHKHKHKKLFKKILKYL；步骤(4)对应得到的细胞穿膜肽
‑
目的蛋白复合物为Tat
‑
mCherry、ANTP
‑
mCherry、(KFF)3K
‑
mCherry、R9‑
mCher...

【专利技术属性】
技术研发人员：张怀东，李芹，黄建忠，何柳，郭丽君，郭兴，罗鑫格，
申请(专利权)人：福建师范大学，
类型：发明
国别省市：