一种精确检测美白产品对细胞中黑色素含量影响的方法技术

本发明专利技术公开了一种精确检测美白产品对细胞中黑色素含量影响的方法，涉及生物技术领域。本发明专利技术通过细胞计数，使样品处理组、阳性对照组和空白对照组的细胞数量一致，再用裂解液处理，直接检测相同细胞数量的细胞群体内黑色素的含量，检测方法简单，可以排除因不同样品导致细胞数量不同，导致的黑色素含量不同而造成的误差，实验结果能更准确的反应单个细胞产生黑色素的量的变化，且能避免使用考马斯亮蓝、强碱性缓冲液、SDS等试剂对检测结果的影响，能大大提升检测结果的精确度和降低检测成本。同时，用茶碱对细胞进行预处理，能够提高黑色素生成量，保证实验结果的显著性、稳定性和可重复性，解决了现有黑色素检测方法精确度低和检测难度高的问题。和检测难度高的问题。

【技术实现步骤摘要】
一种精确检测美白产品对细胞中黑色素含量影响的方法


[0001]本专利技术涉及生物
，尤其涉及一种精确检测美白产品对细胞中黑色素含量影响的方法。

技术介绍

[0002]随着经济的发展和人们生活水平的提高，美白功效的产品越来越受到人们的追捧，使得市面上美白功效的产的越来越多，然而目前市面上具有美白功效的产品的美白效果参差不齐，因此需要建立构建合适的检测方法检测美白产品的美白效果，现有的标准和检测方法主要是通过检测美白产品对细胞中黑色素生成量的影响，从而评价美白产品的功效。
[0003]现有的标准和检测方法在检测美白产品对细胞中黑色素生成量的影响时，主要有以下两种方法：(1)接种细胞数量相同，培养时长相同，用使细胞存活率不低于75％的浓度的样品，处理相同时间，最后收集到的所有细胞，用相同体积的裂解液裂解，以此得到的黑色素的含量；(2)由于现有技术发展限制，目前尚无法直接测量单个细胞中黑色素的含量，为了精确测量，目前常用的检测方法为：检测一定数量的细胞群体的总黑色素含量，再检测相同数量细胞群体中的总蛋白含量，由于总蛋白含量的相对稳定，用总黑色素含量比总蛋白含量，可得细胞内黑色素的相对含量。
[0004]细胞群体中黑色素的总含量通常是由两部分决定的，一是单个黑色素细胞中的黑色素含量，二是黑色素细胞的数量，在检测过程中需要对样品进行处理，如果样品处理对黑色素细胞的数量影响较大，即使不影响单个细胞黑色素的含量，也会造成整体黑色素含量的变化，因此上述方法(1)检测美白产品对细胞中黑色素生成量的影响的精确度较低，难以精确地评估样品的美白功效；上述方法(2)的检测方法通常需要采用Bradford法检测细胞总蛋白含量，在检测过程中需要用到考马斯亮蓝等试剂，导致检测成本高，且染料易受强碱性缓冲液、 TritonX
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100、SDS等去污剂的影响，使得检测难度高，同时检测时需将细胞分成两份，会引入误差，导致检测结果的精确度大大降低。

技术实现思路

[0005]针对
技术介绍
提出的问题，本专利技术的目的在于提出一种精确检测美白产品对细胞中黑色素含量影响的方法，本专利技术通过细胞计数，使样品处理组、阳性对照组和空白对照组的细胞数量一致，再用裂解液处理，直接检测相同细胞数量的细胞群体内黑色素的含量，使得检测操作更简单，检测验结果的更准确，解决了现有黑色素检测方法精确度低和检测的难度高的问题。
[0006]为达此目的，本专利技术采用以下技术方案：
[0007]一种精确检测美白产品对细胞中黑色素含量影响的方法，包括以下步骤：
[0008](1)检测样品对细胞活性的影响，得到细胞的存活率≥75％的样品浓度，为待测样品；
[0009](2)将对数生长期的细胞接种于6孔板中，在37℃和5％CO2饱和湿度环境下孵育18～24h；
[0010](3)将6孔板中的细胞按照6孔板的孔数分为样品处理组、阳性对照组和空白对照组，在样品处理组中更换含有待测样品的培养基；在阳性对照组中更换含有标准美白成分的培养基，将上述样品处理组、阳性处理组和空白处理组置于培养箱中孵育24～72h；
[0011](4)将步骤(3)处理后的样品处理组、阳性对照组和空白对照组分别弃去上清液后，用胰酶消化制成单细胞悬液，再离心，沉淀用含10％胎牛血清的 DMEM培养基重悬细胞后计数，使样品处理组、阳性对照组和空白对照组的细胞数量一致；
[0012](5)将步骤(4)处理后的样品处理组、阳性对照组和空白对照组分别进行离心处理，沉淀分别用裂解液处理后，于75～85℃的条件下孵育20～40min，用酶标仪分别测定波长475nm下样品处理组、阳性对照组和空白对照组的吸光度，并计算细胞中黑色素的含量。
[0013]进一步的，所述步骤(2)操作如下，将对数生长期的细胞接种于6孔板中，先在37℃和5％CO2饱和湿度环境下孵育4～6h，更换含有茶碱的培养基继续培养14～18小时。
[0014]进一步的，在所述步骤(2)中，含有茶碱的培养基中茶碱的添加量为0.8～1 mM。
[0015]进一步的，在所述步骤(3)中，所述含有待测样品的培养基为含10％胎牛血清的基础培养基，并添加有待测样品和浓度为0.8～1mM的茶碱；
[0016]所述含有标准美白成分的培养基为含10％胎牛血清的基础培养基，并添加有标准美白成分和浓度为0.8～1mM的茶碱；
[0017]所述标准美白成分为熊果苷，所述标准美白成分的浓度和待测样品的浓度相同。
[0018]进一步的，所述步骤(1)中检测样品对细胞活性的影响的操作方法如下：将对数生长期的细胞接种于96孔板，每孔4
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104个，37℃和5％CO2的饱和湿度环境下孵育24h，加入梯度浓度的样品分别处理48h，利用MTT法检测细胞存活率，得到细胞的存活率≥75％的样品浓度，为待测样品。
[0019]进一步的，所述MTT法的操作方法如下：弃去96孔板内培养基，每孔加 0.4mg/mLMTT溶液100μL，在培养箱中孵育1
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3h后，吸去上清，每孔加150μL 二甲基亚砜，振荡后用酶标仪分别测定波长为550nm和650nm下的吸光度，计算细胞存活率，得到细胞的存活率≥75％的浓度。
[0020]进一步的，所述细胞为小鼠皮肤黑色素瘤细胞。
[0021]进一步的，在所述步骤(5)中，所述裂解液为1mol/L的氢氧化钠溶液，且所述氢氧化钠溶液中含有10％二甲基亚砜。
[0022]进一步的，所述美白产品为具有美白效果的原料、提取物和组合物中的任意一种。
[0023]上述技术方案具有以下有益效果：
[0024]1、为了降低检测的难度和成本，本技术方案通过细胞计数，使样品处理组、阳性对照组和空白对照组的细胞数量一致，再用相同体积的裂解液处理，直接检测相同细胞数量的细胞群体内黑色素的含量，使得检测操作更简单，检测验结果更准确，可以排除因不同样品导致细胞数量不同，导致的黑色素含量不同而造成的误差，整个检测过程操作简单，不需要额外的试剂，实验结果能更准确的反应单个细胞产生黑色素的量的变化，且能避免使用考马斯亮蓝、强碱性缓冲液、TritonX
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100、SDS等试剂，对检测结果的影响，从而能大大提升检测结果的精确度和降低检测成本。
[0025]2、本技术方案在步骤(2)中，将对数生长期的细胞在37℃和5％CO2饱和湿度环境下孵育4～6h后，更换含有茶碱的培养基继续培养14～18小时，在培养基中加入茶碱，用茶碱对细胞进行预处理后再加样品处理，茶碱能够调节细胞中促黑素细胞激素(melanocyte
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stimulating hormone，MSH)的产生，而MSH 能够能促进黑色素生成，因此，通过在培养基中加入茶碱能够增加细胞中黑色素的基础生成量，使得比较样品处理组、阳性对照组和空白对照组三者之间黑色素含量的差异时更加显著，能更清楚和显著的评估样品的美白功效，同时也可以降低甚至避免由于人本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种精确检测美白产品对细胞中黑色素含量影响的方法，其特征在于，包括以下步骤：(1)检测样品对细胞活性的影响，得到细胞的存活率≥75％的样品浓度，为待测样品；(2)将对数生长期的细胞接种于6孔板中，在37℃和5％CO2饱和湿度环境下孵育18～24h；(3)将6孔板中的细胞按照6孔板的孔数分为样品处理组、阳性对照组和空白对照组，在样品处理组中更换含有待测样品的培养基；在阳性对照组中更换含有标准美白成分的培养基，将上述样品处理组、阳性处理组和空白处理组置于培养箱中孵育24～72h；(4)将步骤(3)处理后的样品处理组、阳性对照组和空白对照组分别弃去上清液后，用胰酶消化制成单细胞悬液，再离心，沉淀用含10％胎牛血清的DMEM培养基重悬细胞后计数，使样品处理组、阳性对照组和空白对照组的细胞数量一致；(5)将步骤(4)处理后的样品处理组、阳性对照组和空白对照组分别进行离心处理，沉淀分别用裂解液处理后，于75～85℃的条件下孵育20～40min，用酶标仪分别测定波长475nm下样品处理组、阳性对照组和空白对照组的吸光度，并计算细胞中黑色素的含量。2.根据权利要求1所述的精确检测美白产品对细胞中黑色素含量影响的方法，其特征在于，所述步骤(2)操作如下，将对数生长期的细胞接种于6孔板中，先在37℃和5％CO2饱和湿度环境下孵育4～6h，更换含有茶碱的培养基继续培养14～18小时。3.根据权利要求2所述的精确检测美白产品对细胞中黑色素含量影响的方法，其特征在于，在所述步骤(2)中，含有茶碱的培养基中茶碱的添加量为0.8～1mM。4.根据权利要求3所述的精确检测美白产品对细胞中黑色素含量影响的方法，其特征在于，在所述步骤(3)中，所述含有待测样品的培养基为含10％...

【专利技术属性】
技术研发人员：钟晓明，孙文，胥萍，
申请(专利权)人：钟晓明，
类型：发明
国别省市：