一种识别卵巢癌耐药病人细胞外囊泡的核酸适体及其应用制造技术

本发明专利技术公开了一种识别卵巢癌耐药病人细胞外囊泡的核酸适体及其应用，属于生物技术领域。本发明专利技术通过细胞筛选得到的核酸适体具有较强的亲和力与特异性、较低的免疫原性、能够体外化学合成、成本低、分子量小、可以对核酸适体的不同部位进行修饰和取代、序列稳定、易于保存。本发明专利技术核酸适体可以用于制备抗肿瘤药物、制备卵巢癌耐药细胞株或卵巢癌耐药病人血清外泌体检测试剂盒或卵巢癌耐药病人血清外泌体检测探针。体检测探针。体检测探针。

【技术实现步骤摘要】
一种识别卵巢癌耐药病人细胞外囊泡的核酸适体及其应用


[0001]本专利技术涉及生物
，具体涉及一种识别卵巢癌耐药病人细胞外囊泡的核酸适体及其应用。

技术介绍

[0002]卵巢癌是女性常见三大恶性肿瘤之一，也是当今世界上最致命的恶性妇科肿瘤。目前临床上主要治疗卵巢癌的手段是手术和化疗，其中顺铂、紫杉醇是临床治疗卵巢癌常用的化疗药物。卵巢癌由于早期缺乏典型症状，且卵巢解剖位置较深，确诊时多已为晚期；加之大部分患者对化疗都会出现不同程度的耐药反应，导致卵巢癌患者长期生存率很低。
[0003]核酸适体是能够紧密结合特定靶标分子的单链DNA或RNA分子。这些寡核酸链是通过体外指数富集的配体系统进化（SELEX）获得的。核酸适体又称为“化学抗体”，与蛋白质结合时，适体具有许多优势，包括免疫原性低，合成成本低，批次差异小，以及化学修饰简便等优点。Cell
‑
SELEX是指以活细胞为靶标，进行适配体的筛选的一种SELEX技术。Cell
‑
SELEX技术提供了鉴定针对已知生物标志物的适配体和细胞膜表面上的新生物标志物的机会。在Cell
‑
SELEX中，靶分子具有其自身的天然构象，这使得用于治疗和诊断应用的适配体开发更容易。它还减轻了处理靶分子构象的复杂性，并增加了找到有效适配体的可能性。
[0004]目前针对核酸适体的研究逐渐增加，中国专利CN111944819A公开了一种快速筛选的卵巢癌核酸适体及其在制备检测卵巢癌制剂中的应用，其公开的核酸适体相较于传统的抗体，具有识别的靶标范围广且特异性强，亲和力强，毒性和免疫原性低的特点，但并不能用于检测卵巢癌病人是否出现耐药性。部分研究针对癌症耐药性的核酸适体，例如中国专利CN109337909A公开了一种检测肝癌耐药细胞株的核酸适体及其应用，但针对鉴别卵巢癌耐药性的核酸适体鲜有研究。

技术实现思路

[0005]本专利技术提供一种具有较好的亲和力、低免疫原性、分子量小、能够体外化学合成、序列稳定、便于保存、方便标记、易于修饰的核酸适体，可用于区分卵巢癌耐药病人和化疗敏感病人血清中提取的细胞外囊泡。
[0006]为达到上述专利技术目的，采用如下技术方案。
[0007]一种识别卵巢癌耐药病人细胞外囊泡的核酸适体，包括如下序列中的至少一种：（1）如SEQIDNO.1所示的序列；（2）SEQIDNO.1所示序列的互补序列；（3）由上述（1）或（2）中序列转录得到的RNA序列。
[0008]本专利技术还提供了一种筛选上述核酸适体的方法，为使用Cell
‑
SELEX筛选。
[0009]优选地，使用Cell
‑
SELEX筛选包括如下步骤：（1）核酸文库和引物的设计；（2）正筛；
（3）文库的扩增；（4）ssDNA文库的制备；（5）反筛；（6）正筛；（7）核酸适体循环筛选；（8）检测。
[0010]更优选地，步骤（1）所设计的核酸文库为：SEQIDNO.2：5
’‑
AAGGAGCAGCGTGGAGGATA(N)
45
TTAGGGTGTGTCGTCGTGGT
‑3’
。
[0011]更优选地，步骤（1）所设计的引物为：上游引物：SEQIDNO.3：5
’‑
异硫氰酸荧光素
‑
AAGGAGCAGCGTGGAGGATA
‑3’
；下游引物：SEQIDNO.4：5
’‑
生物素
‑
ACCACGACGACACACCCTAA
‑3’
。
[0012]更优选地，步骤（2）的具体步骤包括：将核酸文库与靶细胞株进行孵育，孵育完成后加热变性分离即得第一轮筛选的核酸文库。
[0013]更优选地，步骤（3）的具体步骤包括：将步骤（2）中筛选所得的核酸文库使用步骤（1）中设计的引物进行PCR扩增。
[0014]更优选地，步骤（4）的具体步骤包括：用链霉亲和素葡聚糖微球分离生物素标记步骤（3）中的PCR扩增产物；然后利用氢氧化钠使双链DNA变性解链，收集异硫氰酸荧光素标记的DNA单链文库；最后脱盐柱对单链DNA进行脱盐。
[0015]更优选地，步骤（5）的具体步骤包括：将步骤（4）所得到的DNA单链文库与对照细胞孵育，然后收集细胞孵育后的上清，即排除掉非特异性结合的核酸序列。
[0016]更优选地，步骤（6）的具体步骤包括：将步骤（5）中所制上清液与靶细胞孵育，洗脱保留结合靶细胞的核酸序列，即得第二次筛选的核酸文库。
[0017]更优选地，步骤（7）的具体步骤包括：以步骤（6）所得的核酸文库取代步骤（2）所得到的扩增产物，并重复步骤（4）
‑
（6）的筛选过程，直到筛选得到与靶细胞细胞株结合能力强的核酸文库。
[0018]更优选地，步骤（7）共进行10
‑
20轮筛选。
[0019]更进一步优选地，步骤（7）共进行15轮筛选。
[0020]更优选地，步骤（8）的具体步骤包括：将多轮筛选获得的富集核酸文库，利用流式细胞术检测与靶细胞株和对照细胞株的结合选择性。
[0021]更进一步优选地，上述靶细胞株为卵巢癌耐紫杉醇细胞株A2780/PTX。
[0022]更进一步优选地，上述对照细胞株为紫杉醇敏感细胞株A2780。
[0023]本专利技术利用Cell
‑
SELEX技术，以卵巢癌耐紫杉醇细胞株A2780/PTX为靶标细胞，以紫杉醇敏感细胞株A2780为对照细胞，进行细胞差异筛选，从而得到获得特异性识别靶标细胞的核酸适体。所得核酸适体具有较强的亲和力与特异性并且分子量小、易于修饰和保存。
[0024]本专利技术还提供一种识别卵巢癌耐药病人细胞外囊泡的核酸适体，其特征在于，所述核酸适体包括与（1）中序列具有60％以上同源性的DNA序列。
[0025]本专利技术还提供一种识别卵巢癌耐药病人细胞外囊泡的核酸适体，其特征在于，所述核酸适体包括对上述的核酸适体进行修饰得到的序列，修饰包括以下修饰方法的至少一种：（1）磷酸化；（2）甲基化；（3）氨基化；（4）巯基化；（5）同位素化；（6）用硫取代氧；（7）用硒取代氧。
[0026]本专利技术还提供一种识别卵巢癌耐药病人细胞外囊泡的核酸适体，核酸适体包括对上述的核酸适体进行改造得到的序列。
[0027]优选地，改造包括以下改造方法的至少一种：（1）在核酸适体上连接荧光标记物；（2）在核酸适体上连接放射性物质；（3）在核酸适体上连接治疗性物质；（4）在核酸适体上连接生物素；（5）在核酸适体上连接地高辛；（6）在核酸适体上连接纳米发光材料；（7）在核酸适体上连接小肽；（8）在核酸适体上连接siRNA。
[0028]本专利技术还提供一种识别卵巢癌耐药病人细胞外囊泡的核酸适体的衍生物，衍生物包括以下至少一种：（1）由上述的核酸适体骨架衍生出的硫代磷酸酯骨架序列；（2）本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种识别卵巢癌耐药病人细胞外囊泡的核酸适体，包括如下序列中的至少一种：（1）如SEQIDNO.1所示的序列；（2）SEQIDNO.1所示序列的互补序列；（3）由上述（1）或（2）中序列转录得到的RNA序列。2.一种识别卵巢癌耐药病人细胞外囊泡的核酸适体，其特征在于，所述核酸适体包括与SEQIDNO.1所示序列具有60％以上同源性的DNA序列。3.一种识别卵巢癌耐药病人细胞外囊泡的核酸适体，其特征在于，所述核酸适体包括对权利要求1或2中所述的核酸适体进行修饰得到的序列。4.根据权利要求3所述的核酸适体，其特征在于，所述修饰包括以下修饰方法的至少一种：（1）磷酸化；（2）甲基化；（3）氨基化；（4）巯基化；（5）同位素化；（6）用硫取代氧；（7）用硒取代氧。5.一种识别卵巢癌耐药病人细胞外囊泡的核酸适体，其特征在于，所述核酸适体包括对权利要求1或2中所述的核酸适体进行改造得到的序列。6.根据权利要求5所述的核酸适体，其特征在于，所述改造包括以下改造方法的至少一种：（1）在核酸适体上连...

【专利技术属性】
技术研发人员：谭蔚泓，张慧，肖亚婷，甘绍举，
申请(专利权)人：浙江省肿瘤医院，
类型：发明
国别省市：