一株产生育酚的重组裂殖壶菌、其构建方法及应用技术

本发明专利技术提供一株产生育酚的重组裂殖壶菌、其构建方法及应用。所述重组裂殖壶菌含有来来源于拟南芥的香叶基香叶基二磷酸还原酶基因GGH、来源于小球藻的尿黑酸植基转移酶基因HPT、和来源于镰孢菌的γ

【技术实现步骤摘要】
一株产生育酚的重组裂殖壶菌、其构建方法及应用


[0001]本专利技术属于基因工程
，具体涉及一株产生育酚的重组裂殖壶菌，还涉及所述重组菌株的构建方法，及其在生产生育酚中应用。

技术介绍

[0002]生育酚(tocopherol)属于维生素E(Vitamin E)的一个类型，其主要来源于植物种子的油脂中，生育酚和生育三烯酚具有抵抗日常膳食中脂类物质被氧化的能力，这种能力通常被定义为为“维生素E活性”。维生素E的应用领域非常广泛，可以添加在化妆品、护肤品中，还可以作为医疗保健品预防各种疾病，在动植生命中有着不可替代的重要地位，故而人类对维生素E的需求量巨大。但是目前的一些化学合成、生物提取的方法存在收率低、纯度不高、浪费较大、易污染环境、设备昂贵、操作复杂及质量差等问题。因此，通过生物技术手段调控一些关键酶基因的表达，成为天然生育酚合成的新途径。
[0003]裂殖壶菌(Schizochytrium)属于破囊壶藻科，是一类海洋异养微生物，以裂殖的方式进行繁殖，其单细胞内能够积累大量对人体有益的活性物质，如油脂、色素(类胡萝卜素、叶黄素和虾青素等)、角鳖烯等，这类物质的合成所用到的共同前体物质乙酰辅酶A在裂殖壶菌中含量比较高，这也是这类活性物质能大量积累的原因。生育酚合成的一个前体物质是植基二磷酸(PDP)，而植基二磷酸是由香叶基香叶基二磷酸(GGPP)在4
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羟苯丙酮酸二加氧酶(HPPD)的作用下合成的，香叶基香叶基二磷酸同时也是类胡萝卜素合成的前体物质，所以我们尝试在类胡萝卜素合成通路的基础上构建生育酚合成通路，寻找天然生育酚合成的新途径。
[0004]本专利通过对生育酚合成途径中关键酶基因的挖掘，在裂殖壶菌中构建生育酚异源合成途径，得到一株能合成生育酚的裂殖壶菌重组菌株。

技术实现思路

[0005]本专利技术的目的是在裂殖壶菌中构建生育酚异源合成途径，同时进行生育酚合成途径中关键基因的挖掘，提供一种产生育酚的重组工程菌株，以及该重组菌株的构建方法和应用。
[0006]本专利技术的思路是通过筛选能够在裂殖壶菌中成功表达的生育酚合成基因，在裂殖壶菌中构建生育酚异源合成途径，得到一株能合成生育酚的裂殖壶菌重组菌株。
[0007]基于此，本专利技术提供一株重组裂殖壶菌，所述重组裂殖壶菌含有来来源于拟南芥的香叶基香叶基二磷酸还原酶基因GGH、来源于小球藻的尿黑酸植基转移酶基因HPT、和来源于镰孢菌的γ
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生育酚甲基转移酶基因γ
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TMT。
[0008]在本专利技术中，所述基因GGH的核酸序列如SEQ ID No.1所示，所述基因HPT的核酸序列如SEQ ID No.2所示，所述基因γ
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TMT的核酸序列如SEQ ID No.3所示。
[0009]本专利技术还提供上述重组裂殖壶菌的构建方法，所述方法包括以下步骤：
[0010](1)构建汗GGH基因、HPT基因以及γ
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TMT基因的重组质粒
[0011]获取来源于拟南芥的香叶基香叶基二磷酸还原酶基因GGH、来源于小球藻的尿黑酸植基转移酶基因HPT和来源于镰孢菌的γ
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生育酚甲基转移酶基因γ
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TMT的序列，合成并添加酶切位点，并在序列末端连接EGFP基因；将合成片段与质粒pBluZeo
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18S分别经酶切和连接构建重组质粒pBluZeo
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18S
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AtGGH、pBluZeo
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GaHPT
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18S和pBluZeo
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Ftγ
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TMT
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18S，将所得重组质粒热激转化大肠杆菌感受态细胞，筛选阳性转化子并测序验证正确；
[0012](2)重组质粒转化裂殖壶菌
[0013]将上述重组质粒酶切线性化处理后，取10μl加入100μl裂殖壶菌ATCC 20888感受态细胞，混匀后转移至预冷的电转杯，冰上静置30min后进行电击，电击结束后立即加入1ml预冷的含1M山梨醇的种子培养基，轻轻混匀后转移至预冷的含1M山梨醇的4mL种子培养基中，28℃、200rpm培养2h；然后取300μL菌液均匀涂于含50μg/mL博来霉素的固体平板，置于28℃培养箱培养24h，所得单菌落提取基因组进行PCR验证并验证正确；
[0014](3)构建重组裂殖壶菌ATCC
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20889
[0015]将步骤(2)中验证成功的重组质粒pBluZeo
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AtGGH
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18S，pBluZeo
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GaHPT
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18S，pBluZeo
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Ftγ
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TMT
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18S中的AtGGH，GaHPT和Ftγ_TMT片段通过酶切连接，然后连在质粒pBluZeo
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18S上获得重组质粒pBluZeo
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AtGGH
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GaHPT
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Ftγ_TMT
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18S，酶切线性化处理后，电击法法转入裂殖壶菌中，获得重组菌株ATCC
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20889(ATCC
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pBl
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AtGGH
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GaHPT
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Ftγ_TMT)。
[0016]根据一种优选的实施方式，上述步骤(3)的裂殖壶菌、即本专利技术的出发菌株是裂殖壶菌ATCC
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20889。
[0017]本专利技术还提供上述重组裂殖壶菌在生产生育酚中的应用。
[0018]优选地，所得重组裂殖壶菌在种子培养基中，180
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220rpm、27
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29℃恒温摇床里培养48
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72h，然后以3
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6％的接种量接入发酵培养基中，180
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220rpm、27
‑
29℃恒温摇床里培养3
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5d。
[0019]根据一种优选的实施方式，所述种子培养基含有：葡萄糖40g/L、酵母膏2g/L、谷氨酸钠10g/L、KH2PO
4 4g/L、NaCl 15g/L、MgCl
2 3g/L、CaCl2·
2H2O 1g/L、KCl 2g/L、MgSO4·
7H2O 5g/L、FeCl30.1g/L；
[0020]所述发酵培养基含有：葡萄糖40g/L、酵母膏2g/L、谷氨酸钠10g/L、KH2PO
4 4g/L、NaCl 15g/L、MgCl
2 3g/L、(NH4)2SO
4 6g/L、KCl 2g/L、MgSO4·
7H2O 5g/L、FeCl
3 0.1g/L。
[0021]本专利技术的香叶基香叶基二磷酸还原酶从来源于油菜、向日葵、花生、拟本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一株重组裂殖壶菌，其特征在于重组裂殖壶菌含有来来源于拟南芥的香叶基香叶基二磷酸还原酶基因GGH、来源于小球藻的尿黑酸植基转移酶基因HPT、和来源于镰孢菌的γ
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生育酚甲基转移酶基因γ
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TMT。2.根据权利要求1所述的重组裂殖壶菌，其特征在于所述基因GGH的核酸序列如SEQ ID No.1所示，所述基因HPT的核酸序列如SEQ ID No.2所示，所述基因γ
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TMT的核酸序列如SEQ ID No.3所示。3.权利要求1所述的重组裂殖壶菌的构建方法，所述方法包括以下步骤：(1)构建汗GGH基因、HPT基因以及γ
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TMT基因的重组质粒获取来源于拟南芥的香叶基香叶基二磷酸还原酶基因GGH、来源于小球藻的尿黑酸植基转移酶基因HPT和来源于镰孢菌的γ
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生育酚甲基转移酶基因γ
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TMT的序列，合成并添加酶切位点，并在序列末端连接EGFP基因；将合成片段与质粒pBluZeo
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18S分别经酶切和连接构建重组质粒pBluZeo
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18S
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AtGGH、pBluZeo
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GaHPT
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18S和pBluZeo
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Ftγ
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TMT
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18S，将所得重组质粒热激转化大肠杆菌感受态细胞，筛选阳性转化子并测序验证正确；(2)重组质粒转化裂殖壶菌将上述重组质粒酶切线性化处理后，取10μl加入100μl裂殖壶菌ATCC 20888感受态细胞，混匀后转移至预冷的电转杯，冰上静置30min后进行电击，电击结束后立即加入1ml预冷的含1M山梨醇的种子培养基，轻轻混匀后转移至预冷的含1M山梨醇的4mL种子培养基中，28℃、200rpm培养2h；然后取300μL菌液均匀涂于含50μg/mL博来霉素的固体平板，置于28℃培养箱培养24h，所得单菌落提取基因组进行PCR验证并验证正确；(3)构建重组裂殖壶菌ATCC
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20889将步骤(2)中验证成功的重组质粒pBluZeo
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AtGGH
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18S，pBluZeo
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【专利技术属性】
技术研发人员：苟元元，杨璐，郭建琦，牛永洁，孟永宏，邢武，
申请(专利权)人：陕西海斯夫生物工程有限公司，
类型：发明
国别省市：