核酸检测试剂及其应用制造技术

本发明专利技术涉及核酸检测技术领域，尤其涉及核酸检测试剂及其应用。通过与微球连接的DNA链之间发生的趾托介导的链置换(TMSD)反应，使微球形成凝集块，至肉眼可见，实现无需设备的现场结果判读和检测，且显著降低成本。该方法中联合使用检测靶标的捕获、催化探针簇放大，以及多级TMSD反应，和微球凝集反应，实现样品信号106‑8倍放大以及结果的肉眼直接判读。本发明专利技术所开发的传感系统具有高灵敏度和高特异性，由于该方法不需要复杂的操作或昂贵的设备，无需生物酶参与，无需扩增待测靶标，成本低廉，是一种在检测条件受限的现场条件下的简单有效的、高灵敏、高特异性的定性及半定量检测手段，具有广泛的用途。有广泛的用途。

【技术实现步骤摘要】
核酸检测试剂及其应用


[0001]本专利技术涉及核酸检测
，尤其涉及核酸检测试剂及其应用。

技术介绍

[0002]分子诊断在健康领域具有广泛的应用，可用于临床诊断、传染病防控、环境污染检测等。分子诊断中的核酸诊断，即检测待检物中是否含有特定序列的核酸，使用最为广泛。各种特定序列的核酸诊断标志物是疾病诊断的重要依据。在传染病防控工作中，是否携带传染病病原体是决定传染病防控措施，如隔离等的直接依据。
[0003]目前，最常用的核酸诊断方法是实时多聚酶链反应(RT
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PCR)，具有灵敏度高，可检测aM量级的靶标核酸，且结果稳定。但是RT
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PCR也有一些缺点：1)酶驱动的扩增反应，试剂成本高，且需要冷冻保存，增加储存、运输成本；
[0004]2)适合于200bp以上的目标检测，无法检测更短的核酸靶标，尤其是<30bp；3)对于RNA靶标，需要进行反转录才能检测，效率低，也是酶促反应，增加检测复杂度；4)检测需要昂贵设备和荧光检测系统，在一定检测条件下完成，设备和检测条件成本高；5)手工操作复杂，耗时耗力。尤其不适于没有检测条件的现场环境。
[0005]近年来，基于核酸分子杂交和微球技术实现的核酸特异捕获以及无酶检测技术不断发展，包括微球制备和功能化表面修饰、基于核酸热动力学的短DNA趾托介导的链置换(TMSD，Toehold
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mediated strand displacement)反应，如：催化发夹式DNA组装(CHA)和杂交链式反应(HCR)等越来越广泛的应用于核酸检测，并通过微流控等装置，实现现场级结果判读。然而这些新技术的灵敏度往往还在pM量级，难以企及RT
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PCR所能达到的灵敏度。
[0006]因此，开发灵敏度更高，且不需要复杂的设备条件和电力供应的适合现场条件的快速核酸检测试剂，是本领域亟待解决的问题。

技术实现思路

[0007]有鉴于此，本专利技术要解决的技术问题在于提供高灵敏度的核酸检测试剂及其应用。
[0008]本专利技术提供的探针组合，包括捕获探针、催化探针簇和TMSD反应探针组；
[0009]所述捕获探针固定于固定相，特异性识别待测物；
[0010]所述催化探针簇包括靶向片段和催化探针，所述靶向片段特异性识别待测物，其中：
[0011]靶向片段和催化探针的末端皆修饰有丙烯酰胺基，与丙烯酰胺单体或双丙烯酰胺聚合成凝胶微珠探针簇；
[0012]或者，主干单链DNA的两端分别连接靶向片段和微球，催化探针与主干单链DNA杂交形成枝状探针簇。
[0013]本专利技术中，所述固定相包括孔板、磁珠或色谱柱。一些实施例中，所述固定相为磁珠。捕获探针与磁珠的连接方式包括共价键、生物素
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亲和素、金硫键等。本专利技术中，所述磁
珠为超顺磁微球。在本专利技术实施例中，磁珠表面修饰链霉亲核素，而捕获探针末端修饰生物素。捕获探针与磁珠连接后，称为捕获磁珠。
[0014]本专利技术中，所述捕获探针Cap1的长度为20～40bp，所述催化探针中的靶向片段的长度为20～40bp，所述捕获探针在待测物上的识别位点与催化探针中的靶向片段的识别位点间隔30～200bp。
[0015]为了避免磁珠对捕获探针识别效果的影响，在捕获探针Cap1的生物素标记端在Cap1序列和磁珠之间插入PloyA片段，其长度为10～15bp。
[0016]本专利技术中的催化探针簇的作用是扩大信号，本专利技术通过捕获探针Cap1和靶向片段Cap2与目标核酸的杂交形成“三明治”结构(图2)，其中捕获探针Cap1固定于固相，如超顺磁微球(磁珠)，实现目标核酸的特异捕获和富集；靶向片段Cap2附着于催化探针簇，而催化探针簇中含有大量催化探针，以这些催化探针启动TMSD反应，能够起到放大信号的作用，提高检测的灵敏度。
[0017]本专利技术中，靶向片段Cap2和催化探针C偶联，其中Cap2与目标核酸结合，靶向片段Cap2与催化探针C的摩尔比可以是1：1～1:100。催化探针簇是包含多个催化探针的聚合物，并通过可逆反应实现结合和解离。
[0018]催化探针簇中的靶向片段Cap2与目标核酸结合而被捕获，而催化探针簇中催化探针C的载量就决定的此步骤的信号放大倍数。利用不同的催化探针装载策略，可以实现105‑6的催化探针装载量，并将信号放大105‑6倍。固相捕获可将目标核酸富集10
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100倍数，两项累积共可将目标核酸的信号放大106‑8倍
[0019]本专利技术中催化探针簇有两种形式，其中一种中，靶向片段Cap2和催化探针的末端皆修饰丙烯酰胺基，经过聚合反应形成聚丙烯酰胺凝胶的微球，该微球上携带有靶向片段Cap2和催化探针。这种形式的催化探针簇被称为凝胶微珠探针簇，在凝胶微珠探针簇中加入DTT后加热，可使微球解聚，释放催化探针。
[0020]在本专利技术中，所述凝胶微珠探针簇中，催化探针的长度为30～50bp，所述靶向片段和催化探针的摩尔比为1：(2～20)。
[0021]而另一种催化探针簇中，靶向片段Cap2与一个主干单链DNA相连，主干单链DNA通过共价键或生物素
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亲和素与微球相连，主干单链DNA可以与多个催化探针杂交。这种形式的催化探针簇被称为枝状探针簇。通过加热或者直接加入与加入与主干DNA反向互补的DNA探针能够使枝状探针簇中的催化探针释放。
[0022]本专利技术中，所述枝状探针簇中，所述主干单链DNA的结构，由固定端至游离端依次包括与微球连接的分子、linker、(ployT或ployA、间隔区片段、催化探针杂交互补片段)n、ployT或ployA和所述靶向片段。其中，linker片段的设置是为了避免微球对反应的干扰。
[0023]本专利技术中，所述枝状探针簇中，所述催化探针的长度为30～50bp，其中一端的10～20bp片段与主干单链DNA杂交。
[0024]本专利技术中，所述枝状探针簇中，每个主干单链DNA分子与2～100个催化探针杂交，主干单链DNA的结构中n＝2～100。
[0025]本专利技术中，因捕获探针与磁珠相连，因此，所述枝状探针簇中采用的微球不能够带有磁性。一些实施例中，所述枝状探针簇中微球为聚苯乙烯微球。为了使枝状探针簇与微球连接，所述微球为链霉亲和素微球、羧基微球或氨基微球。
[0026]本专利技术中，所述催化探针的长度为30～50bp，本专利技术对其序列不做限定，凡是能够应用于TMSD反应的催化探针都可以实现本专利技术的目的。具体实施例中，催化探针需避免自身形成发夹结构，也需要避免与Cap2发生杂交，以免干扰反应的进行。
[0027]本专利技术中，所述TMSD反应探针组包括：FH1探针、FH2探针、SH1探针和SH2探针；
[0028]其中FH1探针、FH2探针、SH1探针和SH2探针为发夹结构，且SH1探针和SH2探针的3
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【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.探针组合，其特征在于，包括捕获探针、催化探针簇和TMSD反应探针组；所述捕获探针固定于固定相，特异性识别待测物；所述催化探针簇包括靶向片段和催化探针，所述靶向片段特异性识别待测物，其中：靶向片段和催化探针的末端皆修饰有丙烯酰胺基，与丙烯酰胺单体或双丙烯酰胺聚合成凝胶微珠探针簇；或者，主干单链DNA的两端分别连接靶向片段和微球，催化探针与主干单链DNA杂交形成枝状探针簇。2.根据权利要求1所述的探针组合，其特征在于，所述捕获探针的长度为20～40bp，所述催化探针中的靶向片段的长度为20～40bp，所述捕获探针在待测物上的识别位点与催化探针中的靶向片段的识别位点间隔30～200bp。3.根据权利要求1所述的探针组合，其特征在于，所述固定相包括孔板、磁珠或色谱柱。4.根据权利要求1所述的探针组合，其特征在于，所述凝胶微珠探针簇中，催化探针的长度为30～50bp，所述靶向片段和催化探针的摩尔比为1：(2～20)。5.根据权利要求1所述的探针组合，其特征在于，所述枝状探针簇中，所述主干单链DNA的结构，由固定端至游离端依次包括与微球表面结合的分子、linker、(ployT或ployA、隔离区片段、催化探针C端互补片段)n、ployT或ployA和所述靶向片段；所述催化探针的长度为30～50bp，其中一端的10～20bp的片段与主干单链DNA杂交。6.根据权利要求1、2或5所述的探针组合，其特征在于，每个主干单链DNA分子与2～100个催化探针杂交，主干单链DNA的结构中n＝2～100。7.根据权利要求1～6任一项所述的探针组合，其特征在于，所述...

【专利技术属性】
技术研发人员：康禹，薛勇彪，邵长君，王建，楚亚男，陈婧，
申请(专利权)人：中国科学院北京基因组研究所国家生物信息中心，
类型：发明
国别省市：