通过宏基因组测序确定环境样本中存在预定物种的方法技术

本发明专利技术提出了一种通过宏基因组测序确定环境样本中存在预定物种的方法。该方法包括：(a)获取环境样本；(b)提取所述环境样本的总核酸，所述总核酸包括DNA和RNA；(c)对所述总核酸进行逆转录处理和第二链合成；(d)对步骤(c)的产物进行全基因组扩增处理，以便获得全基因组扩增产物；(e)基于所述全基因组扩增产物构建测序文库；(f)对所述测序文库进行测序，以便获得测序结果；和(g)基于所述测序结果，确定所述环境样本中是否存在所述预定物种。本发明专利技术的方法能够快速准确地判断环境样本中是否存在预定物种，并且可以进行预定物种的谱系建立、溯源追踪。源追踪。

【技术实现步骤摘要】
通过宏基因组测序确定环境样本中存在预定物种的方法


[0001]本专利技术涉及生物
，具体地，涉及通过宏基因组测序确定环境样本中存在预定物种的方法。

技术介绍

[0002]目前，微生物鉴定方法分为培养和非培养两类，临床公认的金标准是分离培养和生化鉴定，但这种方法的操作周期长、阳性率低，并且不能适用于所有病原体，例如多种细菌混合的样本，分离鉴定困难，厌氧菌在分离鉴定的过程中通常会被忽略而造成鉴定不准确。非培养类的方法比如涂片镜检、抗体抗原免疫、PCR等方法时效性强，但在准确性上存在较明显的劣势，且每个项目只能检测某一些特定的病原体，检测数量受到限制，阳性率不高。
[0003]宏基因组二代测序技术(metagenomics next
‑
generation sequencing,mNGS)是借助二代测序平台快速测序获得样品中的核酸序列，并进一步与微生物参考基因组序列库对比，从而得知样品中微生物的种类和比例的技术。随着宏基因组二代测序技术的出现，可以不依赖于培养，直接对样本中的全部微生物核酸序列进行测定。包括直接从临床样本或环境样本中提取全部核酸信息，利用基因组学的研究策略研究样本中所包含的全部微生物信息。
[0004]环境中的微生物呈现多样性，一定程度上可以反映环境中的实时状态，通过对环境微生物的监测，可以实现对环境的动态监测。
[0005]因此，开发一种能够快速准确确定环境样本中存在预定物种的方法，能够对环境样本中的微生物进行实时监测、种群溯源、信息预测的方法很有必要。r/>
技术实现思路

[0006]新型冠状病毒肺炎出现大流行，随着疫情的发展和逐步控制，如何实现对疫情的实时监测具有重要意义。在疫情发生初期，已经发现感染源附近的环境采样样本中均有不同程度的新型冠状病毒检出，证明通过环境样本对新型冠状病毒监测的可行性。因此，本研究通过宏基因组二代测序的技术建立针对环境样本进行预定物种检测的方法，为疫情的防控和实时监测提供支撑。
[0007]在本专利技术的一个方面，本专利技术提出了一种通过宏基因组测序确定环境样本中存在预定物种的方法。根据本专利技术的实施例，所述方法包括：(a)获取环境样本；(b)提取所述环境样本的总核酸，所述总核酸包括DNA和RNA；(c)对所述总核酸进行逆转录处理和第二链合成；(d)对步骤(c)的产物进行全基因组扩增处理，以便获得全基因组扩增产物； (e)基于所述全基因组扩增产物构建测序文库；(f)对所述测序文库进行测序，以便获得测序结果；和(g)基于所述测序结果，确定所述环境样本中是否存在所述预定物种。
[0008]根据本专利技术实施例的方法通过对环境中的气体、液体、固体物质进行直接收集并妥善保存，可以全面准确地获取环境样本中生物体的核酸物质，包括：微生物、动物、植物等
的DNA和RNA，对所获取的核酸进行扩增、建库及测序，全面准确地获取环境样本中的核酸序列信息，利用测序结果与数据库进行分析，采用合理精准地分析方法对目标物种进行变异检测和构建进化树，对其谱系进行追踪与溯源。本专利技术的方法简单准确，可以实现对环境样本中的目标物种实时监控，具有无偏倚、效率高、覆盖广的优势，并且可以对目标物种进行溯源，同时可以适当预测其变异与进化的方向。
附图说明
[0009]图1为根据本专利技术实施例的通过宏基因组测序确定环境样本中存在预定物种的方法；
[0010]图2为根据本专利技术实施例的生物信息学分析流程图；
[0011]图3为根据本专利技术实施例的构建SNP矩阵流程图；
[0012]图4为根据本专利技术实施例的获得测序样本变异位点的流程图；
[0013]图5为根据本专利技术实施例的环境样本宏基因组检测技术流程图；
[0014]图6为根据本专利技术实施例的环境表面拭子样本1文库检测结果；
[0015]图7为根据本专利技术实施例的土壤样本文库检测结果。
[0016]图8为根据本专利技术实施例的45株新冠菌株S基因进化树。
具体实施方式
[0017]下面详细描述本专利技术的实施例，所述实施例的示例在附图中示出。下面通过参考附图描述的实施例是示例性的，旨在用于解释本专利技术，而不能理解为对本专利技术的限制。
[0018]在本专利技术的第一方面，本专利技术提出了一种通过宏基因组测序确定环境样本中存在预定物种的方法。参考图1，根据本专利技术的实施例，所述方法包括：
[0019]S1000,获取环境样本；
[0020]S2000,提取所述环境样本的总核酸，所述总核酸包括DNA和RNA；
[0021]S3000,对所述总核酸进行逆转录处理和第二链合成；
[0022]S4000,对步骤S3000的产物进行全基因组扩增处理，以便获得全基因组扩增产物；
[0023]S5000,基于所述全基因组扩增产物构建测序文库；
[0024]S6000,对所述测序文库进行测序，以便获得测序结果；和
[0025]S7000,基于所述测序结果，进行生物信息学分析，确定所述环境样本中是否存在所述预定物种。
[0026]根据本专利技术实施例的方法基于二代测序技术，对直接采集的环境样本中的核酸进行前处理、扩增、建库及测序等操作，进而对环境样本中的目标物种核酸信息进行检测和分析，通过将环境样本中的核酸信息与数据库进行比对，确定环境样本中是否存在目标物种，所述核酸信息可以为目标物种的特异性核酸序列、特异性修饰、表观遗传修饰、SNP位点、 Indel位点等信息；在确定目标物种存在后，根据环境样本中该物种的核酸信息构建进化树，以便对其进行溯源追踪，以便对其的来源及传播方向进行溯源追踪和预测。
[0027]根据本专利技术的实施例，所述环境样本包括选自下列的至少之一：空气微生物样本、污水样本、固体表面拭子样本、固体表面清洗液和排泄物。根据本专利技术实施例的方法，根据需求确定所要取样的环境，如空气、土壤、水源等，针对目标样本为微生物及对微生物进行
追踪溯源的情况，可以针对人员密集区域，如社区、餐厅、电影院等公共场所进行空气样本、固体表面及水源的采样。采样的样本量可以依据目标物种在空气、固体表面、液体中的一般存在数量，同时结合测序所需核酸样本量确定。对于排泄物、土壤等固体物质以及液体可以直接用采样管收集样本，对于针对固体表面的采样，可以利用拭子进行擦拭采样，或者利用缓冲液等采样用液体试剂冲洗所要采样的固体表面，以便获得采样的样本。
[0028]根据本专利技术的实施例，所述空气样本是利用过滤膜或者吸附材料获得的。根据本专利技术实施例的方法针对空气环境的采样可以直接利用采样管随机收集所要采样环境中的空气或者气溶胶，也可以根据目标物种有针对性地进行空气或者气溶胶的收集，进而避免空气中的颗粒物质、化学物质、某些生物、某些特殊的气体物质对后续的检测造成影响，同时也能够减少空气样本中的生物复杂度，使后续的测序分析过程更加简单准确。针对目标物种确定所需过滤膜或者吸附材料的种类及大小，例如针对病毒等微生物的采样，可以使用孔径在1μm～10μm左右，对微生物截本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种通过宏基因组测序确定环境样本中存在预定物种的方法，其特征在于，包括：(a)获取环境样本；(b)提取所述环境样本的总核酸，所述总核酸包括DNA和RNA；(c)对所述总核酸进行逆转录处理和第二链合成；(d)对步骤(c)的产物进行全基因组扩增处理，以便获得全基因组扩增产物；(e)基于所述全基因组扩增产物构建测序文库；(f)对所述测序文库进行测序，以便获得测序结果；和(g)基于所述测序结果，确定所述环境样本中是否存在所述预定物种。2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述环境样本包括选自下列的至少之一：空气微生物样本、污水样本、固体表面拭子样本、固体表面清洗液和排泄物。3.根据权利要求2所述的方法，其特征在于，所述空气样本是利用过滤膜或者吸附材料获得的。4.根据权利要求3所述的方法，其特征在于，所述过滤膜设置在换气设备上，所述换气设备被配置为适于通过压差使环境空气通过所述过滤膜。5.根据权利要求4所述的方法，其特征在于，所述换气设备设置有流量计，所述流量计被配置为确定通过所述过滤膜的环境空气体积。6.根据权利要求5所述的方法，其特征在于，所述换气设备设置有提醒部件，所述提醒部件基于所述流量计的结果发出可识别信号。7.根据权利要求3所述的方法，其特征在于，所述吸附材料进一步含有指示试剂，所述指示试剂被配置为在吸收预定量二氧化碳后变色。8.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，在步骤(c)中，所述逆转录处理采用特异性引物和随机引物组合的方式进行。在步(d)中，所述全基因组扩增处理采用随机引物进行。9.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述环境样本含有微生物，所述微生物包括细菌、病毒、真菌、衣原体和支原体的至少之一，所述病毒包括DNA病毒和RNA病毒的至少之一。10.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述测序是采用DNA纳米球技术进行的。11.根据权利要求9所述的方法，其特征在于...

【专利技术属性】
技术研发人员：申奥，宫艳萍，吴红龙，尹烨，
申请(专利权)人：华大生物科技武汉有限公司深圳华大基因股份有限公司，
类型：发明
国别省市：