一种基于催化酶激活的靶向交联剂在蛋白分析中的应用制造技术

本发明专利技术涉及一种基于催化酶激活的新型靶向交联剂，实现化学交联反应在特定亚细胞器中的靶向、可控激活，从而进行亚细胞器靶向的蛋白质复合物原位分析。该方法可在细胞原位水平上，实现在特定亚细胞器中或目标蛋白质区域范围内的的靶向性化学交联反应，从而进行亚细胞器时空分辨的蛋白质相互作用的动态变化精准解析。解析。解析。

【技术实现步骤摘要】
一种基于催化酶激活的靶向交联剂在蛋白分析中的应用


[0001]本专利技术涉及一种可在靶向区域内进行可控的化学交联反应，从而实现细胞原位下，快速高效地引发交联反应，进而对目标区域实现高时空分辨的蛋白质相互作用分析。

技术介绍

[0002]蛋白质通过相互作用形成复合物发挥其功能，调控着各项生命过程。精准地表征蛋白质复合物在细胞原位的时空动态变化对于阐释其功能，理解生命现象本质以及揭示重大疾病的发生发展机制具有重要意义1。
[0003]然而，传统的的X射线晶体衍射、冷冻电镜、核磁共振、免疫沉淀
‑
质谱等技术，主要分析体外纯化的蛋白质复合物结构，或细胞裂解液水平的蛋白质相互作用，无法实现蛋白质复合物的细胞内原位解析2。脱离了细胞的原位环境，不仅蛋白质之间真实的相互作用难以表征，并且弱/瞬间的相互作用极易被破环，蛋白质复合物在空间维度上的定位信息也完全丧失。
[0004]化学交联质谱解析技术以能够提供蛋白质相互作用的界面和位点信息、分析通量高、灵敏度高等优点，近年来已成功用于纯化体系及细胞裂解液中蛋白质复合物的规模化解析，并在细胞原位的复合物动态分析中表现出极大的先进性3。然而，蛋白质在细胞中普遍存在多个亚细胞器共定位的特点，并且在不同的亚细胞器中通过调控特定的相互作用网络发挥着不同的功能。但是，由于化学交联反应缺乏空间靶向性，且反应可控性差，无法仅在特定亚细胞器中发生原位交联，故无法表征蛋白质复合物在空间维度上的动态组装。
[0005]本专利技术通过对催化酶激活的新型靶向交联剂的研发和应用，实现交联剂仅在特定亚细胞器中发生化学交联反应，建立基于亚细胞器靶向交联的蛋白质复合物原位分析方法，实现亚细胞器中时空分辨的蛋白质相互作用动态变化精准解析。
[0006]参考文献：
[0007]1.Thul,P.J.；Akesson,L.；Wiking,M.；Mahdessian,D.；Geladaki,A.；Ait Blal,H.；Alm,T.；Asplund,A.；Bjork,L.；Breckels,L.M.；Backstrom,A.；Danielsson,F.；Fagerberg,L.；Fall,J.；Gatto,L.；Gnann,C.；Hober,S.；Hjelmare,M.；Johansson,F.；Lee,S.；Lindskog,C.；Mulder,J.；Mulvey,C.M.；Nilsson,P.；Oksvold,P.；Rockberg,J.；Schutten,R.；Schwenk,J.M.；Sivertsson,A.；Sjostedt,E.；Skogs,M.；Stadler,C.；Sullivan,D.P.；Tegel,H.；Winsnes,C.；Zhang,C.；Zwahlen,M.；Mardinoglu,A.；Ponten,F.；vonFeilitzen,K.；Lilley,K.S.；Uhlen,M.；Lundberg,E.,A subcellular map of the human proteome.Science 2017,356,3321
‑
3332.
[0008]2.Yang,T.
‑
J.；Chang,Y.
‑
C.；Ko,T.
‑
P.；Draczkowski,P.；Chien,Y.
‑
C.；Chang,Y.
‑
C.；Wu,K.
‑
P.；Khoo,K.
‑
H.；Chang,H.
‑
W.；Hsu,S.
‑
T.D.,Cryo
‑
EM analysis of a feline coronavirus spike protein reveals a uniquestructure and camouflaging glycans.Proc.Natl.Acad.Sci.2020,117,1438
‑
1446.
[0009]3.D.；M.；Z.；Chmel
í
k,J.；Man,P.；Nov
á
k,P.,
Impact of Chemical Cross
‑
Linking on Protein Structure and Function.Anal.Chem.2018,90,1104
‑
1113.

技术实现思路

[0010]为了克服常规化学交联方法反应可控性差，反应速率低，无法进行特定区域原位交联等问题，本专利技术提供一种使用靶向化学交联剂，在区域内酶催化条件下，实现空间区域的原位交联反应，随后采用点击化学反应将交联蛋白接枝上富集基团，选择性富集交联肽段并高效释放从而对该靶向区域的蛋白质相互作用提供信息。该方法具有细胞原位，快速，反应可控的优点，可应用于区域或目标蛋白质复合体的分析。
[0011]为实现上述目的，本专利技术采用的技术方案为：
[0012](1)靶向交联剂的合成：合成一端为过氧化物酶可催化的苯酚集团，一端为光反应基团的靶向交联试剂，作为连接臂的烷基链上含有可富集基团；
[0013](2)细胞培养：选择线粒体表达或高尔基体表达等亚细胞器区域或目标蛋白质融合表达辣根过氧化物酶的细胞、真菌或细菌培养至80％
‑
90％密度；
[0014](3)交联剂溶液的配制：使用水、缓冲液或乙腈、有机醇类、有机酸类、DMF或DMSO中的一种或二种以上的有机溶剂配制成浓度为1μM
‑
1M的交联剂溶液
[0015](4)标记溶液的配制：将交联剂母液用细胞培养液DMEM或MEM或R1640等中的一种稀释，加入细胞中，孵育30min；
[0016](5)加入终浓度为1mM的过氧化氢溶液，混匀，静置1min；
[0017](6)配制含10mM抗坏血酸钠，5mM Trolox，10mM叠氮化钠的缓冲盐溶液为淬灭溶液，加入细胞中，静置2min；重复一次；
[0018](7)使用pH为7.1
‑
10的碳酸氢铵缓冲盐溶液、磷酸缓冲盐溶液、4
‑
羟乙基哌嗪乙磺酸缓冲盐溶液或三羟甲基氨基甲烷缓冲盐溶液中的一种或二种以上，且不含与所用交联剂上反应基团反应的基团的缓冲液冲洗去除淬灭溶液；
[0019](8)加入缓冲盐溶液，将细胞置于紫外光下照射30s
‑
10min；
[0020](9)刮下或用胰酶消化下细胞，用超声辅助或液氮冻融破碎细胞；所述的反应条件为15
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40℃反应10min
‑
2h或0
‑
10℃反应10min
‑
10h；
[0021](10)向蛋白样品中加入分体式富集试剂，摩尔量为2
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10倍于交联剂摩尔量，催化剂为CuSO4与THPTA或BTTAA孵育5m本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种基于催化酶激活的靶向交联剂在蛋白分析中的应用，其特征在于：所述的靶向交联剂为C3
‑
C20烷基链二端具有活性基团的有机物；一端活性基团为过氧化物酶激活的苯酚基团，另一端活性基团为可控光反应基团的双吖丙啶基团、三氟甲基双吖丙啶基团、苯基三氟甲基双吖丙啶基团中的一种；作为连接臂的C3
‑
C20烷基链上含有可富集基团如生物素、炔基、叠氮基团中的一种或二种以上；1)将靶向交联剂用有机溶剂配成溶液，加入至细胞培养液中，将细胞培养液加入细菌、真菌或细胞中孵育后，加入过氧化氢溶液进行自由基反应激活后加入淬灭溶液，接着光照引发光反应；2)交联反应完成后，用缓冲液清洗细菌、真菌或细胞，收集细菌、真菌或细胞，进行蛋白提取；3)加入分体式富集试剂，使交联蛋白修饰上富集臂；进行蛋白沉淀，去除多余未反应的富集试剂；4)采用pH为1
‑
6.5的酸性缓冲溶液或pH为7.5
‑
14的碱性缓冲溶液配制的溶有表面活性剂和/或有机溶剂的溶解液来溶解交联蛋白样品，加入还原剂，高温孵育，同时进行蛋白质样品的变性及还原；5)加入烷基化试剂对变性及还原后的蛋白质样品进行烷基化反应后，向蛋白质样品中加入蛋白酶溶液进行酶解；6)向步骤(5)的酶解产物中加入富集材料；7)使用盐溶液或表面活性剂洗去富集材料上非特异性吸附的肽段；8)使用洗脱溶液将富集材料上键合的肽段释放出来，除盐，冻干并重溶，进行质谱分析和数据检索。2.按照权利要求1所述的应用，其特征在于：步骤(1)中所述的有机溶剂，为乙腈、有机醇类、有机酸类、二甲基甲酰胺或二甲基亚砜中的一种或二种以上，交联剂浓度为1μM
‑
1M；步骤(1)中所述的细胞培养液为常用培养液细胞培养液RPMI
‑
1640，DMEM，F12培养基等中的一种，细菌真菌培养液为LB培养液，高氏一号培养基，TB培养基等中的一种；所用细胞为线粒体表达过氧化物酶或细胞核表达过氧化物酶，或EGFR蛋白表达过氧化物酶等通过构建克隆的方法将过氧化物酶与细胞器靶向肽或其中蛋白融合的细胞系中的一种；交联剂的终浓度为10nM
‑
100mM；孵育10
‑
60分钟；过氧化氢终浓度为0.5
‑
10mM，处理时间为30s
‑
5min；淬灭溶液为含1
‑
50mM抗坏血酸钠、1
‑
50mM Trolox、1
‑
50mM叠氮化钠的缓冲盐溶液，淬灭处理时间为30s
‑
5min；光激发波长为光反应基团所需波长，为254nm或365nm；光照处理时间为10s
‑
10min；步骤(1)和(2)中缓冲液为pH为7.1
‑
10的碳酸氢铵缓冲盐溶液、磷酸缓冲盐溶液、4
‑
羟乙基哌嗪乙磺酸缓冲盐溶液或三羟甲基氨基甲烷缓冲盐溶液中的一种或二种以上。3.按照权利要求1所述的应用，其特征在于：步骤(2)中所述收集细胞的过程为胰酶消化或细胞刮消化或离心收集得到的细胞样品；步骤(2)中所述蛋白提取采用细胞裂解的方法，细胞裂解方法为机械裂解或反复冻融法等裂解方法中的一种或二种以上；上述机械裂解方法，于细胞中加入蛋白酶抑制剂即PMSF、Antipain、抑肽酶、EDTA等中的一种或多种后；使用匀浆器、超声仪、研钵或组织捣碎机等对组织或细胞样品进行裂解。4.按照权利要求1所述的应用，其特征在于：步骤(3)所述分体式富集试剂为C3
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C20烷
基链二端具有活性基团的有机物，一端活性基团为炔基或叠氮基团，一端活性基团为生物素，作为连接臂的C3
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C20烷基链上含有可断裂基团如的偶氮基团、二烷氧基二苯基硅烷、二硫键基团中的一种；步骤(3)中所述的蛋白沉淀方法包括甲醇沉淀、丙酮沉淀或甲醇氯仿沉淀法。5.按照权利要求1所述的应用，其特征在于：步骤(4)中所述的蛋白质样品溶解液中，pH为1
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6.5的酸性缓冲溶液，由甲酸、三氟乙酸、三氯乙酸或醋酸溶液配制而成；所述的pH为7.5
‑
14的碱性缓冲缓冲溶液为碳酸氢铵缓冲盐溶液、磷酸缓冲盐溶液、4
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羟乙基哌嗪乙磺酸缓冲盐溶液或三羟甲基氨基甲烷缓冲盐溶液中的一种或二种以上；所述的蛋白质...

【专利技术属性】
技术研发人员：张丽华，安雨馨，赵群，杨开广，戴忠鹏，张玉奎，
申请(专利权)人：中国科学院大连化学物理研究所，
类型：发明
国别省市：