BstDNA聚合酶突变体及其应用和产品、基因、重组质粒和基因工程菌制造技术

本发明专利技术提供了一种Bst DNA聚合酶突变体及其应用和产品、基因、重组质粒和基因工程菌，涉及生物技术领域。本发明专利技术提供的Bst DNA聚合酶突变体，将野生型Bst DNA聚合酶的第370位的Met突变为Gly，第444位的Ala突变为Gly。该Bst DNA聚合酶突变体热稳定性好，非特异性扩增反应减少，重复性好，能够应用于环介导等温扩增技术中。技术中。技术中。

【技术实现步骤摘要】
Bst DNA聚合酶突变体及其应用和产品、基因、重组质粒和基因工程菌


[0001]本专利技术涉及生物
，尤其是涉及一种Bst DNA聚合酶突变体及其应用和产品、基因、重组质粒和基因工程菌。

技术介绍

[0002]DNA聚合酶自发现起始就获得了生物医学界的广泛关注，因此也被广泛应用。Bst DNA聚合酶(Bst DNA polymerase)由E．coli菌株产生，含有来自Bacillus stearothermophilus DNA 聚合酶的基因，该基因缺失了5'
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3'外切核酸酶结构域，但有5'
→
3'DNA聚合酶活性，不具有5'
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3'外切核酸酶活性。Bst DNA聚合酶具有较强的热稳定性和链置换活性，被广泛地用于富含GC碱基对的DNA测序、纳克级含量DNA模板的快速测序、DNA的等温扩增、多重链置换扩增(multiple displacement amplifi
‑
cation，MDA)和全基因组扩增 (whole genome amplification，WGA)。此外，Bst DNA聚合酶还能启动模板依赖的DNA合成，在3'末端随机添加核苷酸。以Bst DNA聚合酶为基础而开发的核酸等温扩增检测技术得到了迅猛的发展，正逐步在分子生物学、医学、法学、食品检验领域广泛应用．目前，以Bst DNA聚合酶为基础的核酸等温扩增检测技术应用较多的是滚环扩增(rolling circle amplifi
‑
cation，RCA)技术和环介导等温扩增(loop
‑
mediated isothermal amplification，LAMP)技术。滚环扩增技术具有特异性强、灵敏度高、快速简便以及高通量测定等特点而被广泛应用，但是由于在检测过程中出现背景信号，给该方法的应用带来了一定的局限性。虽然研究人员尽可能采取措施减少背景信号的出现，降低其对检测的影响，却未能彻底解决该问题，也未能对背景信号产生的机理解释楚。LAMP技术是日本学者Notomi在2000年专利技术的，他利用特殊的引物设计方法和恒温核酸链置换酶，可以在60分钟内，将少量目标DNA扩增到千百万份。目前该技术应用已经有超过20年的历史。LAMP技术是一种新型的核酸扩增方法，其特点是针对靶基因的6
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8个区域设计4
‑
6种特异引物，进行高度特异性扩增反应。在链置换酶Bst DNA聚合酶的作用下，与特殊设计的引物形成环结构，在60～65℃进行恒温扩增，大约15～60min可实现109～1010倍的核酸扩增，具有操作简单。LAMP反应温度一般在65℃，扩增程度小于250nt。DNA产物非常长，大于20KB，由80
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250bp的短目标序列多次重复形成，与长链共聚体中的单链环区相连。这些产品通常不适合下游操作，但目标扩增非常的多，因此有可能有多种检测模式。采用插层或探针、横向流动和琼脂糖凝胶检测等方法的实时荧光检测均与LAMP反应直接兼容。LAMP设备通常需要加热到所需反应温度，并在需要时实时荧光进行定量测量。该技术不依赖任何专门的贵重仪器设备，具有简单、快速、特异性强的特点，能够媲美甚至优于PCR技术，而检测成本远低于荧光定量PCR。但是，LAMP技术的最大缺陷是容易产生非特异性扩增反应，非特异性扩增反应发生的原因还未见明确的报道。
[0003]有鉴于此，特提出本专利技术。

技术实现思路

[0004]本专利技术的第一目的在于提供一种Bst DNA聚合酶突变体，以解决上述问题中的至少一种。
[0005]本专利技术的第二目的在于提供上述Bst DNA聚合酶突变体在制备环介导等温扩增产品中的应用。
[0006]本专利技术的第三目的在于提供一种环介导等温扩增产品。
[0007]本专利技术的第四目的在于提供一种基因，该基因编码上述Bst DNA聚合酶突变体。
[0008]本专利技术的第五目的在于提供一种重组质粒。
[0009]本专利技术的第六目的在于提供一种基因工程菌。
[0010]第一方面，本专利技术提供了一种Bst DNA聚合酶突变体，所述Bst DNA聚合酶突变体的氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示。
[0011]作为进一步技术方案，所述Bst DNA聚合酶突变体的核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示。
[0012]第二方面，本专利技术提供了上述Bst DNA聚合酶突变体在制备环介导等温扩增产品中的应用。
[0013]第三方面，本专利技术提供了一种环介导等温扩增产品，包括上述Bst DNA聚合酶突变体。
[0014]第四方面，本专利技术提供了一种基因，所述基因编码上述Bst DNA聚合酶突变体。
[0015]作为进一步技术方案，所述基因具有SEQ ID NO.2所示的核苷酸序列。
[0016]第五方面，本专利技术提供了一种重组质粒，所述重组质粒包括载体和上述基因。
[0017]作为进一步技术方案，所述载体包括pET
‑
24a(+)质粒。
[0018]第六方面，本专利技术提供了一种基因工程菌，所述基因工程菌含有上述重组质粒。
[0019]作为进一步技术方案，所述基因工程菌包括大肠杆菌。
[0020]与现有技术相比，本专利技术具有如下有益效果：本专利技术提供的Bst DNA聚合酶突变体，将野生型Bst DNA聚合酶的第370位的Met突变为Gly，第444位的Ala突变为Gly。该Bst DNA聚合酶突变体热稳定性好，非特异性扩增反应减少，重复性好，能够应用于环介导等温扩增技术中。
附图说明
[0021]为了更清楚地说明本专利技术具体实施方式或现有技术中的技术方案，下面将对具体实施方式或现有技术描述中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图是本专利技术的一些实施方式，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其他的附图。
[0022]图1为野生型Bst DNA聚合酶的构象分析；图2为Bst
Mut
在LAMP不同温度条件下的结果对比；图3为实施例3的扩增结果。
具体实施方式
[0023]下面将结合实施方式和实施例对本专利技术的实施方案进行详细描述，但是本领域技
术人员将会理解，下列实施方式和实施例仅用于说明本专利技术，而不应视为限制本专利技术的范围。基于本专利技术中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本专利技术保护的范围。未注明具体条件者，按照常规条件或制造商建议的条件进行。所用试剂或仪器未注明生产厂商者，均为可以通过市售购买获得的常规产品。
[0024]第一方面，本专利技术提供了一种Bst DNA聚合酶突变体，所述Bst DNA聚合酶突变体的氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示：MKKKLVLIDGNSVAYRAFFALPLLHNDKGIHTNAVYGFTMMLNKILAEEQPTHLLVAFD本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种Bst DNA聚合酶突变体，其特征在于，所述Bst DNA聚合酶突变体的氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示。2.根据权利要求1所述的Bst DNA聚合酶突变体，其特征在于，所述Bst DNA聚合酶突变体的核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示。3.权利要求1或2所述的Bst DNA聚合酶突变体在制备环介导等温扩增产品中的应用。4.一种环介导等温扩增产品，其特征在于，包括权利要求1或2所述的Bst DNA聚合酶突变体。5.一种基因，其特征在于，所述基因编码权利要求1或2所...

【专利技术属性】
技术研发人员：刁含文，
申请(专利权)人：南京巨匠生物科技有限公司，
类型：发明
国别省市：