靶向削减替加环素耐药基因tetX及其耐药质粒的gRNA、可转移型敲除载体及其应用制造技术

本发明专利技术涉及生物技术领域，具体涉及一种靶向削减替加环素耐药基因tetX及其耐药质粒的gRNA、可转移型敲除载体及其应用。本发明专利技术提供靶向敲除替加环素耐药基因tetX及携带tetX多重耐药质粒的gRNA序列，该序列如下所示：gRNA

【技术实现步骤摘要】
靶向削减替加环素耐药基因tetX及其耐药质粒的gRNA、可转移型敲除载体及其应用


[0001]本专利技术涉及生物
，具体涉及靶向替加环素耐药基因tetX及其耐药质粒的gRNA、一种可水平转移的基因敲除载体及其在耐药基因tetX和耐药质粒削减方面的应用。

技术介绍

[0002]自人类专利技术抗生素以来，抗生素就被广泛应用于临床医疗及养殖业。然而，人体或动物体摄入的抗生素并不能被完全吸收，大量的抗生素及其代谢产物被排放入污水处理系统甚至自然环境中，使得微生物所面临的选择性压力也日益增加，“进化”出抗生素耐药基因，进而获得能在抗生素选择下仍能生存的耐药性。耐药基因所在的位置的多样化的，它们既可位于染色体，进行垂直传播，也可以位于质粒等移动元件上，通过接合转移等方式迁移水平传播。替加环素是一种广谱甘氨酰环肽类抗生素，目前被视为对抗碳青霉烯类耐药肠杆菌感染的最后一道防线。近年来，替加环素耐药基因tetX在医院，养殖业等环境中被广泛检出，它编码的蛋白能使替加环素失活，赋予细菌替加环素耐药性。已有研究表明，耐药基因tetX在多重耐药质粒上被广泛检出，这些耐药质粒往往可以通过水平转移进行跨种属传播。当致病菌获取这些耐药质粒后，就难以被替加环素杀灭，对人类和动物健康有着潜在的健康风险。
[0003]目前，现有的削减抗生素耐药基因的技术往往通过影响细菌群落结构或者直接灭活细菌，例如，通过改变环境条件使得细菌群落组成发生变化，从而影响多重耐药质粒的传播，或者通过紫外消毒、氯消毒等杀菌手段，将细菌直接灭活，使得供体细菌难以将耐药质粒传播到受体细菌。然而，现有的技术难以将耐药质粒的结构完全破坏，排放入环境中的耐药质粒仍能在适宜的条件下被受体细菌捕获，使得耐药基因在环境中持续传播。因此，采用基因敲除系统直接靶向敲除耐药基因tetX及其耐药质粒的削减方法可以直接破坏耐药基因的结构，从而克服上述难题。同时，利用可水平转移型敲除载体投递靶向替加环素耐药基因及其耐药质粒的敲除系统可以使削减过程更加可持续，有利于更好的控制tetX基因在环境中的迁移传播。

技术实现思路

[0004]为了解决现有技术存在的问题，本专利技术提供了一种靶向削减替加环素耐药基因tetX及其耐药质粒的gRNA、可水平转移型敲除载体及其应用，具体包括靶向耐药基因tetX及其耐药质粒的gRNA，可水平转移的敲除载体、载体构建方法及其在携带tetX多重耐药质粒削减方面的应用，该技术可用于环境等领域耐药基因tetX迁移传播的控制。
[0005]本专利技术的实现过程如下：
[0006]第一方面，本专利技术构建了一种可水平转移的基因敲除载体pCas9
‑
OriT，其特征在于，所述质粒包含敲除蛋白Cas9，gRNA表达序列，水平转移位点OriT。
[0007]第二方面，上述pCas9
‑
OriT质粒的构建方法包括如下步骤：
[0008](1)以pCas9质粒为模板，利用高保真PCR技术扩增复制子、氯霉素标记基因以及Cas9敲除蛋白基因，并将PCR产物凝胶纯化。
[0009](2)以携带转移位点的质粒为模板，利用高保真PCR技术扩增该质粒的转移位点，凝胶纯化后获得OriT。
[0010](3)利用无缝克隆技术连接上述步骤1和步骤2纯化后的产物。
[0011](4)将上述连接产物转化入特定大肠杆菌，该大肠杆菌染色体上整合了pCas9
‑
OriT载体水平转移所需要的转移系统。
[0012](5)利用氯霉素筛选标记筛选出阳性克隆，细菌扩大培养后提取质粒，该质粒即为可转移型的载体pCas9
‑
OriT。
[0013]第三方面，本专利技术提供靶向敲除替加环素耐药基因tetX及携带tetX多重耐药质粒的gRNA序列，该序列如下所示：
[0014]gRNA
tetX
‑
1：5
’‑
CCTACACAAAGGTTCAGGTC
‑3’
[0015]gRNA
tetX
‑
2：5
’‑
CGGCTAATGGCTGCTCATCA
‑3’
[0016]第四方面，本专利技术提供靶向敲除耐药基因tetX及携带tetX多重耐药质粒的敲除载体pCas9
‑
OriT
‑
gRNA
tetX
‑
1和pCas9
‑
OriT
‑
gRNA
tetX
‑
2，上述载体图谱分别如附图1和附图2所示。
[0017]上述pCas9
‑
OriT
‑
gRNA
tetX
‑
1和pCas9
‑
OriT
‑
gRNA
tetX
‑
2质粒特征在于，既能以特定大肠杆菌为供体，利用细菌间的接合作用发生水平转移，也可以通过转化的方式进入受体菌，靶向敲除tetX基因的对应位点。
[0018]第五方面，本专利技术提供上述敲除载体pCas9
‑
OriT
‑
gRNA
tetX
‑
1和pCas9
‑
OriT
‑
gRNA
tetX
‑
2的构建方法，具体地说，包含如下步骤：
[0019](1)分别设计gRNA
tetX
‑
1和gRNA
tetX
‑
2的退火引物，序列如下：
[0020]gRNA
tetX
‑
1正向引物：5
’‑
AAACCCTACACAAAGGTTCAGGTCG
‑3’
[0021]gRNA
tetX
‑
1反向引物：5
’‑
AAAACGACCTGAACCTTTGTGTAGG
‑3’
[0022]gRNA
tetX
‑
2正向引物：5
’‑
AAACCGGCTAATGGCTGCTCATCAG
‑3’
[0023]gRNA
tetX
‑
2反向引物：5
’‑
AAAACTGATGAGCAGCCATTAGCCG
‑3’
[0024](2)将上述正向引物和反向引物磷酸化并分别退火，纯化回收后得到靶向耐药基因tetX及其耐药质粒的gRNA双链，退火体系如下：
[0025]在50ul的反应体系中，加入5ul T4 PNK缓冲液，5ul 10mM的ATP，1ul T4 PNK酶，50uM的正向与反向引物各2ul，最后用灭菌水补齐至50ul。37℃反应45min后，将温度上调至95℃，持续10min，再以1℃/min的速度缓慢降至室温。
[0026](3)用限制性核酸本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.特异性靶向替加环素耐药基因tetX及携带tetX耐药质粒的gRNA，其特征在于，其编码的核苷酸序列为gRNA
tetX
‑
1：5
’‑
CCTACACAAAGGTTCAGGTC
‑3’
，gRNA
tetX
‑
2：5
’‑
CGGCTAATGGCTGCTCATCA
‑3’
。2.含有权利要求1所述特异性靶向耐药基因tetX及携带tetX多重耐药质粒的gRNA的CRISPR/Cas9基因敲除载体pCas9
‑
OriT
‑
gRNA
tetX
‑
1和pCas9
‑
OriT
‑
gRNA
tetX
‑
2。3.一种构建权利要求2所述的基因敲除载体pCas9
‑
OriT
‑
gRNA
tetX
‑
1和pCas9
‑
OriT
‑
gRNA
tetX
‑
2的方法，其特征在于，包括如下步骤：(1)根据权利要求1所述的gRNA
tetX
‑
1和gRNA
tetX
‑
2序列设计退火引物，分别为：gRNA
tetX
‑
1正向引物：5
’‑
AAACCCTACACAAAGGTTCAGGTCG
‑3’
gRNA
tetX
‑
1反向引物：5
’‑
AAAACGACCTGAACCTTTGTGTAGG
‑3’
gRNA
tetX
‑
2正向引物：5
’‑
AAACCGGCTAATGGCTGCTCATCAG
‑3’
gRNA
tetX
‑
2反向引物：5
’‑
AAAACTGATGAGCAGCCATTAGCCG
‑3’
(2)将gRNA
tetX
‑

【专利技术属性】
技术研发人员：陈红，林泽俊，周振超，帅馨怡，
申请(专利权)人：浙江大学，
类型：发明
国别省市：