一种胚胎干细胞无血清保存液及其制备方法和应用技术

本发明专利技术属于细胞生物学领域，具体涉及一种胚胎干细胞无血清保存液及其制备方法和应用。所述保存液包括以下体积百分比的组分：血小板裂解物10～30％、低分子量γ

【技术实现步骤摘要】
一种胚胎干细胞无血清保存液及其制备方法和应用


[0001]本专利技术属于生物
更具体地，涉及一种胚胎干细胞无血清保存液及其制备方法和应用。

技术介绍

[0002]人胚胎干细胞(human embryonic stem cell，hES细胞)是从早期的胚胎内细胞团(inner cell mass，ICM)分离培养成的多能干细胞，其在体外培养过程中可以维持干细胞的未分化状态，正常的二倍体核型及无线的增殖能力，具有内分化能力和种系的嵌合能力，并可在体外进行各种基因操作，因此，hES细胞具有广阔的临床应用前景。
[0003]目前，hES细胞常用的冷冻保存方法包括慢速冷冻法和玻璃化冷冻法，两种方法在冷冻过程中需要结合冷冻保护剂使用。其中，慢速冻存法的复苏率约为16％，并且复苏后大量细胞会分化；国际上报导的玻璃化冻存法冻存hES细胞的存活率在75％左右。
[0004]现有的冷冻保护剂主要分为渗透性冷冻保护剂和非渗透性冷冻保护剂，其中，渗透性冷冻保护剂多为小分子中性物质，其能够弱化水结晶过程以及减少对细胞结构和功能的破坏，常用的有甘油、DMSO、丙二醇、乙二醇、乙酰胺、甲醇等。其中，DMSO是临床常用的冷冻保护剂，常以10％DMSO配合90％FBS来冷冻保存干细胞，但是一系列的研究表明，DMSO可能会改变染色体的稳定性，并导致细胞端粒长度的变化，从而导致肿瘤的形成，并且DMSO本身也具有一定的毒性，DMSO对组织和细胞的毒性取决于暴露时间、温度和浓度；另外，FBS作为异源动物成分，存在引入病毒的风险，同时受血清生产批次、来源及组分的影响，对冷冻保存的干细胞可能存在不良的影响。因此，尤其需要低毒性，无血清的冷冻保存液。
[0005]人血小板裂解物来源于人类血小板，不容易引起异种蛋白的免疫，且包含种细胞生长因子，在中国专利申请CN108617638A中，专利技术人提出了一种细胞冻存保护液，其包括血小板裂解物、渗透性保护剂、非渗透性保护剂和血清，专利技术人证实了，该保存液相比不含血小板裂解物的冻存保护液能够更好的保护冻存的细胞，冻存的细胞活力和活率明显提高，且对原代培养后的细胞活率无影响。但是该保存液仍然需要加入4～70％体积分数的血清。Wang等通过使用97％人类血小板裂解物+3％DMSO来冻存hADSC，复苏后发现细胞的存活率高于80％，与95％FBS+5％DMSO冻存存活率无明显差异，且可以减少DMSO的浓度，同时可释放多种生长因子促进hADSC体外增殖，对于血小板裂解物促进细胞的生长基质及其在其他干细胞中的冻存效果还需进一步了解
[1]。但是该冻存液中仍然需要添加3％的DMSO。
[0006]目前未见采用人血小板裂解物来培养hESCs的例子。
[0007][1]Wang C，Xiao R，Cao YL，etal.Evaluation of human plateletlysate an d dimethyl sulfoxide as cryoprotectants for the cryopreservation of human adip ose
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derived stem cells[J].Biochem Biophys Res Commun,2017,491(1):198
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203.

技术实现思路

[0008]本专利技术要解决的技术问题是克服现有冻存液的缺陷和不足，提供一种胚胎干细胞
无血清保存液，其特点在于不含有血清和DMSO。该冻存液可以提高细胞的冷冻存活率，与玻璃化冷冻结合冷冻保存胚胎干细胞复苏率可以达到95％以上，且细胞复苏后维持不分化的状态。
[0009]本专利技术的目的是提供一种胚胎干细胞无血清保存液，包括以下体积百分比的组分：
[0010]血小板裂解物
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10～30％
[0011]低分子量γ
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聚谷氨酸
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1～5％
[0012]缓冲液
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余量。
[0013]进一步地，所述胚胎干细胞无血清保存液包括以下体积百分比的组分：
[0014]血小板裂解物
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10～25％
[0015]低分子量γ
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聚谷氨酸
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1～3％
[0016]缓冲液
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余量。
[0017]进一步地，所述胚胎干细胞无血清保存液包括以下体积百分比的组分：
[0018]血小板裂解物
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16％
[0019]低分子量γ
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聚谷氨酸
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1％
[0020]缓冲液
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余量。
[0021]上述方案中，血小板裂解物是从人血液中提取分离得到的，其含有血小板衍生生长因子、转化生长因子、胰岛素样生长因子等，这些生长因子对细胞的生存是有利的，目前血小板裂解物有被应用于冷冻保存hADSC、间充质干细胞、脂肪干细胞等，但是不知其用于冻存胚胎干细胞的效果如何。
[0022]γ
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聚谷氨酸属于非渗透性冷冻保护剂，其具有强大的水分子络合能力，能够减少冷冻过程中细胞内冰晶的形成，目前有专利技术人采用人血白蛋白、干细胞生长因子、γ
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聚谷氨酸结合甘油来冻存干细胞，冻存12个月后干细胞的存活率仍然高达97％以上。但不知将其与血小板裂解物结合用于冻存胚胎干细胞的效果如何。
[0023]通常地，不同分子量的γ
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聚谷氨酸表现出不同的生理活性，专利技术人意外发现，不同分子量的γ
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聚谷氨酸与血小板裂解物结合冷冻胚胎干细胞表现出差异较大的效果。通过摸索试验发现，低分子量的γ
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聚谷氨酸与血小板裂解物组合对于提高细胞存活率及维持细胞不分化的状态是更有利的。
[0024]进一步地，本文中所述低分子量的γ
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聚谷氨酸是指γ
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聚谷氨酸的分子量最好在5～70kDa之间；更进一步地，所述γ
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聚谷氨酸的分子量最好在10～70kDa、20～70kDa、30～70kDa、40～70kDa、50～70kDa、60～70kDa之间；更进一步地，所述γ
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聚谷氨酸的分子量为10kDa、20kDa、30kDa、40kDa、50kDa、60kDa或70kDa；更进一步地，所述γ
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聚谷氨酸的分子量为10kDa；更进一步地，所述γ
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聚谷氨酸的分子量为70kDa。
[0025]本领域的技术人员知晓，低分子量的γ
...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种胚胎干细胞无血清保存液，其特征在于，包括以下体积百分比的组分：血小板裂解物
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10～30％低分子量γ
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聚谷氨酸
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1～5％基础培养基
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余量。2.如权利要求1所述胚胎干细胞无血清保存液，其特征在于，包括以下体积百分比的组分：血小板裂解物
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10～25％低分子量γ
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聚谷氨酸
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1～3％基础培养基
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余量。3.如权利要求1所述胚胎干细胞无血清保存液，其特征在于，包括以下体积百分比的组分：血小板裂解物
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16％低分子量γ
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【专利技术属性】
技术研发人员：桂宝林，邹世洪，
申请(专利权)人：桂宝林，
类型：发明
国别省市：