一种通用型适体生物传感器及在标志物检测领域的应用制造技术

本发明专利技术涉及一种通用型适体生物传感器及在标志物检测领域的应用。现有生物传感通常需要针对目标物设计整个传感器的识别单元，显著的限制了传感器应用的灵活性。本发明专利技术目的在于提供一种通用型的生物传感器，通过替换其中的识别元件即可实现灵敏检测。为了实现上述目的，本发明专利技术提供的通用型适体生物传感器，包括磁性探针模块和信号放大模块，其中，磁性探针模块为修饰识别探针的磁珠，所述识别探针中具有检测目标的适体序列；所述信号放大模块包括具孔载体，所述具孔载体包载荧光染料，表面修饰连接链，所述连接链中包括识别探针的反义序列，或包括适体序列。经验证，上述传感器可应用于多种肿瘤标志物的检测，具有良好的检测灵敏度。度。度。

【技术实现步骤摘要】
一种通用型适体生物传感器及在标志物检测领域的应用


[0001]本专利技术属于标志物检测生物传感器
，具体涉及一种通用型适体生物传感器、所 述通用型适体生物传感器在标志物检测领域的应用及一种标志物的检测方法。

技术介绍

[0002]公开该
技术介绍
部分的信息仅仅旨在增加对本专利技术的总体背景的理解，而不必然被视为 承认或以任何形式暗示该信息构成已经成为本领域一般技术人员所公知的现有技术。
[0003]作为生命活动的物质基础，生物体内生物分子的稳态在细胞增殖、分化和凋亡等多种细 胞过程中发挥着不可或缺的作用。其中，某些生物分子的异常表达会导致癌症的发生与发展， 这些生物分子被称为癌症标志物。例如，三磷酸腺苷(Adenosine triphosphate,ATP)，作为 细胞活动的基本能量分子，在癌细胞微环境中表达水平显著高于正常细胞；凝血酶，一种催 化纤维蛋白原转化为纤维蛋白的蛋白酶，在白血病细胞中表达水平升高；血小板衍生生长因 子
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BB(Platelet
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derived growth factor BB,PDGF
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BB)，一种重要的细胞因子，在多种癌细胞 中过表达。癌症标志物表达异常的出现往往早于癌症的临床症状，目前它们的表达水平已经 成为癌症早期诊断的重要依据。值得注意的是，多数癌症标志物仅微量表达，且在癌症早期 阶段的异常变化极其微弱。因此，开发能够区分癌症标志物微弱变化的灵敏检测方法对于癌 症的及早发现和深入研究具有重要意义。
[0004]荧光传感器由于信号响应强，在癌症标志物的灵敏检测中备受关注。尤其是一些荧光传 感器，通过与核酸扩增策略相结合，在癌症标志物检测中显示出更高的灵敏度。目前，大多 数荧光传感器是利用蛋白酶辅助的DNA合成/水解或无酶DNA组装获得放大的信号。然而， 蛋白酶的非特异性作用和DNA组装中不可避免的泄漏会导致假性信号，在一定程度上降低 检测的准确度。此外，在大多数已报道的荧光传感器中，识别单元的序列往往参与信号放大 过程，因此必须针对每个特定目标物设计整个传感器，这限制了传感器检测的灵活性。因此， 为了解决上述问题，有必要开发一种具有新型放大模式的通用型传感器用于多种目标物的灵 敏检测。

技术实现思路

[0005]为了实现微量标志物的灵敏检测，本专利技术设计将磁分离与集束式荧光放大相结合，设计 了一种模块化通用型适体传感器，该传感器是一种通用型检测平台，只需要根据检测目标设 计识别探针，可实现“即插即用”，应用更加广泛。
[0006]本专利技术所述通用型适体传感器由磁性探针模块和集束式放大模块组成。磁性探针模块是 将由适体和锚定DNA组成的识别探针连接到磁珠(Magnetic bead,MBD)上构建的。集束 式荧光放大模块的结构基础是介孔硅纳米颗粒(Mesoporous silica nanoparticle,MSN)，通过 在其孔腔中装载罗丹明6G(Rhodamine 6G,Rh6G)，并其表面通过酰胺缩合修饰连接链(锚 定DNA的反义序列)构建的。连接链负责封堵MSN中的染料和结合暴露的锚定
DNA。当 目标物存在时，目标物与适体的竞争结合使锚定DNA暴露出来。暴露的锚定DNA通过与 连接链杂交捕获集束式荧光放大模块。在外加磁场的作用下，被捕获的集束式荧光放大模块 随MBD的运动被分离出来，并通过加热释放集束式荧光放大模块内的Rh6G，恢复荧光以 指示目标物浓度。在该方法中，通过磁分离可以去除未捕获的集束式荧光放大模块，使适体 传感器用于癌症标志物检测时背景较低；得益于集束式荧光放大的设计，单个目标物结合事 件被转化为一簇Rh6G信号，有助于产生扩增的信号，提高检测的灵敏度；得益于其模块化 的设计，适体传感器仅通过“即插即用”式替换识别探针即可轻松扩展到多种癌症标志物的检 测中。经过可行性验证和条件优化后，该适体传感器被成功用于灵敏检测缓冲液体系中的 ATP、凝血酶和PDGF
‑
BB，检测限分别为2.1nM、4.1pM和2.4pM，并成功在人血清体系 中检测三种目标物。本专利技术展示了一种灵敏检测癌症标志物的通用型适体传感方法，可能为 癌症的早期诊断提供有效的工具。
[0007]基于上述研究成果，本专利技术提供以下技术方案：
[0008]本专利技术第一方面，提供一种通用型适体生物传感器，所述生物传感器包括磁性探针模块 和信号放大模块；其中，磁性探针模块为修饰识别探针的磁珠，所述识别探针中具有检测目 标的适体序列；
[0009]所述信号放大模块包括具孔载体，所述具孔载体包载荧光染料，表面修饰连接链，所述 连接链中包括识别探针的反义序列，或包括适体序列。
[0010]上述第一方面所述的磁性探针模块中：
[0011]优选的，所述磁珠表面修饰链霉亲和素，所述识别探针依靠链霉亲和素与生物素的特异 性结合连接在磁珠表面。
[0012]上述第一方面所述的信号放大模块中：
[0013]所述具孔载体为内部中空并且载体表面分布通孔的球形材料，直径为1～2μm孔径为 1～5nm，表面能够通过物理、化学方式固定连接链；能够满足上述结构特征的载体均可应用 在本专利技术提供的适体生物传感器。本专利技术提供的一种实施方式中，所述球形载体为介孔硅纳 米载体。
[0014]优选的，所述具孔载体为氨基化的介孔硅纳米颗粒，通过酰胺键与连接链连接。
[0015]进一步的，所述介孔硅纳米颗粒采用共缩聚法，制备方法包括如下步骤：将十六烷基三 甲基溴化铵(CTAB)水溶液缓慢加入碱液中，搅拌并加热反应一段时间，向反应液中滴加正 硅酸乙酯(TEOS)和硅烷偶联剂(具体的，为APTES)继续加热反应得到白色固体；分离 所述白色固体洗涤并干燥后加入盐酸和甲醇溶液中回流以去除CTAB，即可得到MSN
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NH2。
[0016]优选的，所述具孔载体内部包载荧光染料，所述荧光染料为包括但不限于罗丹明6G、 罗丹明B、三苯胺及其衍生物中的一种。基于本专利技术的设计思路，所述适体生物传感器在磁 性分离之前，最好不表达荧光信号，当适配体与检测目标结合，锚定DNA与连接链结合， 将封堵在载体内的荧光染料释放后表达荧光信号。为了满足上述设想，本专利技术提供的一种实 施方式中，所述荧光染料采用罗丹明6G，将罗丹明6G装入载体的孔腔中，孔内聚集状态 下的Rh6G分子相互靠近，造成相邻Rh6G分子间的氧杂蒽环结构偶极叠加，激发态的分子 通过非辐射通道衰减或弛豫返回基态，导致荧光淬灭(聚集诱导淬灭效应,ACQ效应)。而 适配体与检测目标结合后，Rh6G失去连接链的封堵，从载体中释放出来，释放后的Rh6G 彼此远离，ACQ效应消失，恢复荧光，从而实现检测信号的放大。
[0017]进一步的，所述介孔硅纳米颗粒表面修饰连接链的方式为，通过酰胺键连接；一种实施方式中，所述连接方式如下：将上述MSN
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NH2进行羧基化，将连接链通过酰胺缩合修饰至介孔硅颗粒表面。
[0018]上述信号放本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种通用型适体生物传感器，其特征在于，所述生物传感器包括磁性探针模块和信号放大模块；其中，磁性探针模块为修饰识别探针的磁珠，所述识别探针中具有检测目标的适体序列；所述信号放大模块包括具孔载体，所述具孔载体包载荧光染料，表面修饰连接链，所述连接链中包括识别探针的反义序列，或包括适体序列。2.如权利要求1所述通用型适体生物传感器，其特征在于，所述磁珠表面修饰链霉亲和素，所述识别探针依靠链霉亲和素与生物素的特异性结合连接在磁珠表面。3.如权利要求1所述通用型适体生物传感器，其特征在于，所述的信号放大模块中：所述具孔载体为内部中空并且载体表面分布通孔的球形材料，直径为1～2μm孔径为1～5nm，表面能够通过物理、化学方式固定连接链；优选的，所述球形载体为氨基化的介孔硅纳米颗粒，通过酰胺键与连接链连接；进一步的，所述介孔硅纳米颗粒采用共缩聚法，制备方法包括如下步骤：将CTAB水溶液缓慢加入碱液中，搅拌并加热反应一段时间，向反应液中滴加TEOS和硅烷偶联剂继续加热反应得到白色固体；分离所述白色固体洗涤并干燥后加入盐酸和甲醇溶液中回流以去除CTAB，即可得到MSN
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NH2；优选的，所述具孔载体内部包载荧光染料，所述荧光染料为包括但不限于罗丹明6G、罗丹明B、三苯胺及其衍生物中的一种。4.如权利要求3所述通用型适体生物传感器，其特征在于，所述介孔硅纳米颗粒表面修饰连接链的方式为，通过酰胺键连接；具体的，所述连接方式如下：将上述MSN
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NH2进行羧基化，将连接链通过酰胺缩合修饰至介孔硅颗粒表面；具体的，所述信号放大模块的制备方法如下：向MSN
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NH2的二甲基甲酰胺溶液中加入丁二酸酐反应后得到所述表面羧基化的介孔硅纳米颗粒；继续加入上述Rh6G溶液，避光搅拌即可得到载有Rh6G的MSN
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COOH红色固体，向其混悬液中加入1
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(3
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二甲氨基丙基)
‑3‑
乙基碳二亚胺盐酸盐和硫代琥珀酰亚胺，搅拌反应以活化羧基，再加入PBS缓冲液和氨基化的连接链，避光反应，即可得到所述信号放大模块。5.如权利要求1所述通用型适体生物传感器，其特征在于，所述识别探针包括锚定DNA及适配体，该实施方式中：所述适配体的3
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端具有适体序列，用于结合检测目标；所述适体序列恰当的长度为20～40个碱基，优选的，为25～40个碱基；所述锚定DNA的5
’
端具有连接链的互补序列，其3
’
端修饰生物素，通过生物素和链霉亲和素的特异性结合连接至磁珠表面；所述连接链的5
’
端具有锚定DNA的互补序列，3
’
具有氨基通过酰胺键连接至具孔载体表面，其余位点通过封闭链进行封闭。6.如权利要求5所述通用型适体生物传感器，其特征在于，一种用于ATP检测的通用型适体生物传感器中，具体序列如下：适配体：GAGAGAACCTGGGGGAGTA...

【专利技术属性】
技术研发人员：姜玮，张楠，丁胜勇，
申请(专利权)人：山东大学，
类型：发明
国别省市：