用于同时鉴别12种肉源食品的多重PCR检测用引物组和方法技术

本发明专利技术公开了用于同时鉴别12种肉源食品的多重PCR检测用引物组和方法，特点是包括马特异性引物对、鸽子特异性引物对、骆驼特异性引物对、兔特异性引物对、鸵鸟特异性引物对、牛特异性引物对、火鸡特异性引物对、狗特异性引物对、鸡特异性引物对、鸭特异性引物对、猫特异性引物对和鹅特异性引物对，包括以下步骤1）样品DNA提取；2）根据马、鸽子、兔子、骆驼、鸵鸟、牛、猫、火鸡、狗、鸡、鸭和鹅基因序列分别设计物种特异性引物；3）多重PCR反应条件的建立；4）进行琼脂糖凝胶电泳检测判断是否掺杂以及掺杂的肉类，优点是操作简单、灵敏度高和特异性好。灵敏度高和特异性好。灵敏度高和特异性好。

【技术实现步骤摘要】
用于同时鉴别12种肉源食品的多重PCR检测用引物组和方法


[0001]本专利技术属于食品质量安全检测
，尤其是涉及一种用于同时鉴别12种肉源食品的多重PCR检测用引物组和方法。

技术介绍

[0002]肉制品为人类提供了必须的营养物质，尤其作为最丰富的蛋白质来源出现在日常饮食中。但是，随着对动物蛋白食品需求的不断增长以及肉价的上涨，肉类掺假的事件也在不断出现且已成为严重的全球性问题。为降低成本，市场上“次肉充好肉”事件频发，更是在2013年欧洲“马肉风波”这一全球性丑闻爆发后连同整个食品市场推上了风口浪尖，极大地动摇了消费者对食品行业的信任。肉类掺假不仅违反了市场规则，还有可能危害公众健康及引发宗教问题。例如某些品种肉类可能引起特定人群的过敏反应；穆斯林国家对于猪肉的忌食等。为此，肉制品的肉源鉴别在食品安全及文化法律等诸多方面都具有重要意义。
[0003]近年来，肉品鉴别技术更新迭代不断发展，包括感官分析、解剖和组织学差异、免疫血清扩散、色谱和DNA杂交等。这其中，尤以基于DNA的分析方法结合聚合酶链反应(polymerase chain reaction，PCR)为一种方便可靠、高灵敏度低成本的检测方法，现已发展成为肉类掺假检测的首选方法。目前，常见的PCR技术有如：多重PCR和实时荧光定量PCR(RT
‑
PCR)。RT
‑
PCR多用于定量分析，多样化肉种类的掺杂十分影响RT
‑
PCR分析的准确性，且该方法对于技术手段及操作费用要求较高。相较而言，多重PCR只需借助简单的琼脂糖凝胶电泳实验即可直观分析肉类掺杂情况，是更理想的检测方法。同时，由于肉类物种的高度同源性，在构建多重PCR系统时常选择具有高拷贝数和高稳定性的线粒体DNA序列作为靶基因。由此，基于线粒体DNA序列，建立快速、准确、敏感的多重PCR肉源检测技术是严格监测市场肉制品安全所急需的技术手段。

技术实现思路

[0004]本专利技术所要解决的技术问题是提供一种操作简单、灵敏度高和特异性好的用于同时鉴别12种肉源食品的多重PCR检测用引物组和方法。
[0005]本专利技术解决上述技术问题所采用的技术方案为：1、一种用于同时鉴别12种肉源食品的多重PCR检测用引物组，包括马特异性引物对、鸽子特异性引物对、骆驼特异性引物对、兔特异性引物对、鸵鸟特异性引物对、牛特异性引物对、火鸡特异性引物对、狗特异性引物对、鸡特异性引物对、鸭特异性引物对、猫特异性引物对和鹅特异性引物对，所述的马特异性引物对的序列为：正向引物：5
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CCCCGCTTCCTCCCTCTGA
ꢀ‑ꢀ3’
，反向引物：5
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TAGGTATGGTTATTTCCGGGACG
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；鸽子特异性引物对的序列为：正向引物：5
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GGCCCAGAAAGCATCACCTC
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，
反向引物：5
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ATTGGTATAGCGATTAGGGACAG
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；骆驼特异性引物对的序列为：正向引物：5
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CTAGCCCAGAAAATACCACAT
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，反向引物：5
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CATAGACGAGTTCGCTCCGTA
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；兔特异性引物对的序列为：正向引物：5
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AATCCGCTTCTACCCCTTG
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，反向引物：5
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TATACCTGTGAGGGCCAGACT
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；鸵鸟特异性引物对的序列为：正向引物：5
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AGCGCCCTCTAGCTCATCC
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，反向引物：5
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GCTGCTTTAGGGCCAACGTG
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；牛特异性引物对的序列为：正向引物：5
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ATGAGCCCACCATATATTCACT
ꢀ‑ꢀ3’
，反向引物：5
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TGTCGTGGTTAAGTCTACAGTCA
ꢀ‑ꢀ3’
；火鸡特异性引物对的序列为：正向引物：5
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AGTTGACCACCGTATAGTAGTCC
ꢀ‑ꢀ3’
，反向引物：5
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TCGTCCTGGGATTGCATCTGTCT
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；狗特异性引物对的序列为：正向引物：5
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CCCTTGCTCGTAATGTCCCT
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，反向引物：5
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CGAGATGTCCCATTTGCGAGA
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；鸡特异性引物对的序列为：正向引物：5
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CAGGTATCAGGCACACTCAGC
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，反向引物：5
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CACTCTTTACGCCGGGTAGC
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；鸭特异性引物对的序列为：正向引物：5
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CCACGCGAATAAAGCATAGCC
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，反向引物：5
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TTTCGTTTGTAGCCCTGGTG
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；猫特异性引物对的序列为：正向引物：5
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TCTTAGCAGCGGGAATCACT
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，反向引物：5
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AAGAGTAGCCAGTCAACTAAACA
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；鹅特异性引物对的序列为：正向引物：5
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TCGCCTTCTCCTCAGTAGCTC
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，反向引物：5
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TGTCGCAGTCTGATACGATT
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。
[0006]2、一种用于同时鉴别12种肉源食品的多重PCR检测方法，包括以下步骤：（1）样品DNA提取根据基因组DNA提取试剂盒使用说明，进行基因组DNA提取，并利用NanoDrop 2000分光光度计测定DNA浓度；（2）多重PCR引物设计利用Oligo 7.0软件结合生物信息学的比对分析，根据马NADH脱氢酶亚基5、鸽子NADH脱氢酶亚基5、兔子NADH脱氢酶亚基5、骆驼16S rRNA、鸵鸟16S rRNA、牛细胞色素c氧化酶亚基I、火鸡细胞色素c氧化酶亚基Ⅱ、狗D
‑
loop、鸡12S rRNA、鸭NADH脱氢酶亚基6、猫细
mM），0.5 μL EasyTaq DNA聚合酶（5 U μL
‑1），0.5 μL 各混合物种上下游引物，1 μL 基因组DNA（0.01
‑
10 ng μL
‑1），用无菌水补足体系至25 μL。利用T1本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种用于同时鉴别12种肉源食品的多重PCR检测用引物组，其特征在于包括马特异性引物对、鸽子特异性引物对、骆驼特异性引物对、兔特异性引物对、鸵鸟特异性引物对、牛特异性引物对、火鸡特异性引物对、狗特异性引物对、鸡特异性引物对、鸭特异性引物对、猫特异性引物对和鹅特异性引物对，所述的马特异性引物对的序列为：正向引物：5
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CCCCGCTTCCTCCCTCTGA
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，反向引物：5
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TAGGTATGGTTATTTCCGGGACG
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；鸽子特异性引物对的序列为：正向引物：5
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GGCCCAGAAAGCATCACCTC
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，反向引物：5
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ATTGGTATAGCGATTAGGGACAG
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；骆驼特异性引物对的序列为：正向引物：5
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CTAGCCCAGAAAATACCACAT
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，反向引物：5
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CATAGACGAGTTCGCTCCGTA
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；兔特异性引物对的序列为：正向引物：5
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AATCCGCTTCTACCCCTTG
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，反向引物：5
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TATACCTGTGAGGGCCAGACT
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；鸵鸟特异性引物对的序列为：正向引物：5
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AGCGCCCTCTAGCTCATCC
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，反向引物：5
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GCTGCTTTAGGGCCAACGTG
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；牛特异性引物对的序列为：正向引物：5
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ATGAGCCCACCATATATTCACT
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，反向引物：5
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TGTCGTGGTTAAGTCTACAGTCA
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；火鸡特异性引物对的序列为：正向引物：5
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，反向引物：5
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TCGTCCTGGGATTGCATCTGTCT
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；狗特异性引物对的序列为：正向引物：5
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CCCTTGCTCGTAATGTCCCT
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，反向引物：5
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CGAGATGTCCCATTTGCGAGA
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；鸡特异性引物对的序列为：正向引物：5
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CAGGTATCAGGCACACTCAGC
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，反向引物：5
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CACTCTTTACGCCGGGTAGC
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；鸭特异性引物对的序列为：正向引物：5
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CCACGCGAATAAAGCATAGCC
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，反向引物：5
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TTTCGTTTGTAGCCCTGGTG
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；猫特异性引物对的序列为：正向引物：5
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TCTTAGCAGCGGGAATCACT
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，反向引物：5
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AAGAGTAGCCAGTCAACTAAACA
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；鹅特异性引物对的序列为：正向引物：5
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TCGCCTTCTCCTCAGTAGCTC
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，
反向引物：5
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TGTCGCAGTCTGATACGATT
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。2.一种用于同时鉴别12种肉源食品的多重PCR检测方法，其特征在于包括以下步骤：（1）样品DNA提取根据基因组DNA提取试剂盒使用说明，进行基因组DNA提取，并测DNA浓度；（2）多重PCR引物设计根据马NADH脱氢酶亚基5、鸽子NADH脱氢酶亚基5、兔子NADH脱氢酶亚基5、骆驼16S rRNA、鸵鸟16S rRNA、牛细胞色素c氧化酶亚基I、火鸡细胞色素c氧化酶亚基Ⅱ、狗D
‑
loop、鸡12S rRNA、鸭NADH脱氢酶亚基6、猫细胞色素c氧化酶亚基I和鹅细胞色素b基因序列分别设计物种特异性引物；其中所述的马特异...

【专利技术属性】
技术研发人员：蔡振东，蓝航镇，郭影琪，潘道东，曾小群，吴振，周松，
申请(专利权)人：宁波大学，
类型：发明
国别省市：