一种高灵敏度的定量检测GFAP试剂盒制造技术

本发明专利技术公开了一种高灵敏度的定量检测GFAP试剂盒，所述定量检测GFAP试剂盒包括FITC

【技术实现步骤摘要】
一种高灵敏度的定量检测GFAP试剂盒


[0001]本专利技术属于生物检测
，具体涉及一种高灵敏度的定量检测GFAP试剂盒。

技术介绍

[0002]创伤性脑损伤(TBI)是由外力引起的大脑损伤，会破坏大脑正常功能，导致人的认知能力或身体机能受损。在所有类型TBI中，最常见的后遗症为头痛(47.9％)和记忆异常(42％)，约三成患者需要心理辅导或神经病学治疗。TBI是神经外科中最常见疾病，也是世界范围内主要的死亡原因及致残因素之一，其后遗症对患者健康有永久性影响。
[0003]疑似TBI的医疗护理流程分为三步，首先使用15分格拉斯哥昏迷量表(GCS)对神经进行评估，以评定脑损伤严重度，然后进行结构性神经影像学检查，最常见的是通过头部CT扫描来可视化骨折和颅内病变，最后根据CT结果制定治疗方案、留院观察或出院。
[0004]目前，CT扫描是广泛用于帮助临床医师评估TBI的唯一客观、简单且可靠的选择。然而， CT结果的正确性与CT设备的准确性及医师的阅片水平直接相关，和其他检测方法相比，是一种相对主观的判断方法。约90％轻度TBI(有时被称为“脑震荡”)的CT扫描结果呈阴性。这些患者中只有不到1％的人需进行神经外科干预。鉴于这些患者的CT扫描阳性百分比非常低且不必要影像学检测可能会增加辐射诱发癌变的风险，寻找开发其他的脑损伤诊断方法来准确判断颅脑损伤程度和评估预后，具有巨大的临床意义和战略意义。
[0005]胶质纤维酸性蛋白(GFAP)是一种Ⅲ型中间纤丝蛋白。人的GFAP由432个氨基酸组成，主要分布于中枢神经系统的星形胶质细胞，参与细胞骨架的构成并维持其张力强度。GFAP 是一种神经系统特异性蛋白，其在脑损伤中对神经系统功能的恢复有重要影响。
[0006]在TBI中，GFAP在1小时内会通过血脑屏障进入血液，导致血清GFAP显著升高。对TBI 的早期诊断，鉴别诊断和判断预后有重要的意义，临床上主要用于脑外伤的辅助诊断。
[0007]CN109521004A公开了一种用于检测胶质纤维酸性蛋白(GFAP)的磁微粒分离化学发光免疫测定法，试剂盒组成包括：校准品、质控品试剂A、试剂B、清洗液浓缩液、发光底物液，其中，校准品为含一系列浓度的胶质纤维酸性蛋白(GFAP)抗原，用于建立标准曲线；质控品为含一定浓度胶质纤维酸性蛋白(GFAP)抗原的缓冲液配制而成；试剂A为含一定浓度磁微粒标记的胶质纤维酸性蛋白(GFAP)抗体溶液；试剂B为含一定浓度碱性磷酸酶标记的胶质纤维酸性蛋白(GFAP)抗体溶液；清洗液浓缩液用于配制清洗液；发光底物液为碱性磷酸酶(ALP) 催化的发光底物溶液。该专利技术提高了免疫反应的信号强度和灵敏度，使低含量物质在进行免疫结合时也能产生很强的化学发光信号，为人体胶质纤维酸性蛋白(GFAP)的检测提供了一种更准确、精确、方便、快捷和简单的方法，但是，该专利技术采用的磁微粒标记的胶质纤维酸性蛋白(GFAP)抗体易聚沉淀，流动性差，使用时易出现挂壁残留，从而使检测过程中发挥作用的颗粒减少，导致测试结果的准确性和稳定性差。
[0008]CN112485445A公开了一种定量检测GFAP的试剂盒及其应用，该专利技术通过改进磁微粒发光法中的磁微粒载体的缓冲体系，改善了磁微粒抗体偶联物的流动性和沉降性能，提高了试剂盒检测结果的准确性和重复性，稳定性好。
[0009]如何在于现有技术的基础上，引进信号放大系统，进一步提高试剂盒的灵敏度，降低材料成本，对提高人外周血胶质纤维酸性蛋白的分析水平具有重要意义。

技术实现思路

[0010]本专利技术的目的在于提供一种高灵敏度的定量检测GFAP试剂盒，通过增加了“FITC
‑
抗 FITC抗体”信号放大体系，增加了试剂盒的灵敏度，降低了主要原料使用量，降低了材料成本。
[0011]术语：
[0012]FITC：异硫氰酸荧光素。
[0013]GFAP：胶质纤维酸性蛋白。
[0014]室温：20
‑
30℃。
[0015]为了实现上述目的，本专利技术采用的技术方案如下：
[0016]本专利技术提供了一种FITC
‑
抗FITC抗体信号放大体系，由FITC标记的GFAP抗体溶液和抗FITC抗体标记的磁微粒溶液组成，
[0017]其中，所述FITC标记的GFAP抗体溶液包括FITC标记的GFAP抗体2偶联物和缓冲液；所述抗FITC抗体标记的磁微粒溶液包括抗FITC抗体标记的磁微粒和缓冲液。
[0018]优选地，所述FITC标记的GFAP抗体2偶联物的制备方法，包括以下步骤：
[0019]A1、抗体2连接FITC
[0020]称取除盐后的FITC用缓冲液15配合成终浓度0.5mg/mL的FITC浓缩液，按FITC与抗体2质量比3:100
‑
15:100的比例，将FITC加入抗体2溶液中进行反应，震荡混匀后在室温下反应，得到FITC抗体2连接物；
[0021]A2、FITC抗体2连接物的纯化
[0022]使用缓冲液作为PD10脱盐柱的平衡液和洗脱液；使用15mL缓冲液清洗PD10脱盐柱，在最后一次清洗的液体完全进入柱料时，加入步骤A1得到的FITC抗体2连接物；
[0023]使用缓冲液将柱内体积补足至2
‑
2.6mL，当柱内液体完全进入柱料时，加入3mL缓冲液开始洗脱，收集蛋白洗脱液，收集量为第一次补足的相应体积(2
‑
2.6mL)；
[0024]将除盐后的FITC抗体2连接物加入超滤浓缩管进行浓缩至0.5
‑
4mg/mL，即得FITC标记的 GFAP抗体2偶联物。
[0025]优选地，所述抗FITC抗体标记的磁微粒的制备方法，包括以下步骤：
[0026]B1、抗FITC抗体的选择及除盐
[0027]使用缓冲液作为PD10脱盐柱的平衡液和洗脱液；使用15mL缓冲液清洗PD10脱盐柱，在最后一次清洗的液体完全进入柱料时，加入需要脱盐的抗FITC抗体；使用缓冲液将柱内体积补足至2
‑
2.6mL，当柱内液体完全进入柱料时，加入3mL缓冲液开始洗脱；收集蛋白洗脱液，收集量为第一次补足的相应体积(2
‑
2.6mL)；
[0028]将除盐后的抗FITC抗体加入超滤浓缩管进行浓缩至0.5
‑
4mg/mL，备用；
[0029]B2、抗FITC抗体连接磁微粒
[0030]按磁微粒：抗FITC抗体质量比100:3
‑
100:20的比例(即1mg磁珠加入30
‑
200ug抗FITC 抗体)，将步骤B1浓缩后的抗FITC抗体加入活化后的磁微粒进行反应，在2
‑
8℃条件下持续混匀反应16
‑
24小时，得到抗FITC抗体磁微粒连接物；
[0031]B3、抗FITC抗体磁微粒连接物的封闭、清洗和重悬。
...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种FITC
‑
抗FITC抗体信号放大体系，其特征在于，由FITC标记的GFAP抗体溶液和抗FITC抗体标记的磁微粒溶液组成，其中，所述FITC标记的GFAP抗体溶液包括FITC标记的GFAP抗体2偶联物和缓冲液；所述抗FITC抗体标记的磁微粒溶液包括抗FITC抗体标记的磁微粒和缓冲液。2.根据权利要求1所述的FITC
‑
抗FITC抗体信号放大体系，其特征在于，所述FITC标记的GFAP抗体2偶联物的制备方法，包括以下步骤：A1、抗体2连接FITC称取除盐后的FITC用缓冲液配合成FITC浓缩液，将FITC加入抗体2溶液中进行反应，震荡混匀后在室温下反应，得到FITC抗体2连接物；A2、FITC抗体2连接物的纯化用缓冲液清洗PD10脱盐柱，在最后一次清洗的液体完全进入柱料时，加入步骤A1得到的FITC抗体2连接物；使用缓冲液将柱内体积补足至2
‑
2.6mL，当柱内液体完全进入柱料时，加入缓冲液开始洗脱，收集蛋白洗脱液，收集量为第一次补足的相应体积；将除盐后的FITC抗体2连接物加入超滤浓缩管进行浓缩至0.5
‑
4mg/mL，即得FITC标记的GFAP抗体2偶联物。3.根据权利要求2所述的FITC
‑
抗FITC抗体信号放大体系，其特征在于，步骤A1中所述FITC与抗体2的质量比为3:100
‑
15:100。4.根据权利要求1所述的FITC
‑
抗FITC抗体信号放大体系，其特征在于，所述抗FITC抗体标记的磁微粒的制备方法，包括以下步骤：B1、抗FITC抗体的选择及除盐用缓冲液清洗PD10脱盐柱，在最后一次清洗的液体完全进入柱料时，加入需要脱盐的抗FITC抗体；使用缓冲液将柱内体积补足至2
‑
2.6mL，当柱内液体完全进入柱料时，加入缓冲液洗脱；收集蛋白洗脱液，收集量为第一次补足的相应体积；将除...

【专利技术属性】
技术研发人员：王法龙，李锋，刘聪，冯玉静，李博飞，郑兴华，
申请(专利权)人：北京美联泰科生物技术有限公司，
类型：发明
国别省市：