一种尿素酶驱动中性粒细胞递药系统及其合成方法技术方案

本发明专利技术公开一种尿素酶驱动中性粒细胞递药系统及其合成方法。首先将尿素酶溶液与磺基NHS生物素溶液反应得到尿素酶

【技术实现步骤摘要】
一种尿素酶驱动中性粒细胞递药系统及其合成方法


[0001]本专利技术涉及用于血栓治疗的系统领域，且特别涉及一种尿素酶驱动中性粒细胞递药系统及其合成方法。

技术介绍

[0002]血栓是血流在心血管系统血管内面剥落处或修补处的表面所形成的小块。在可变的流体依赖型(variable flow dependent patterns)中，血栓由不溶性纤维蛋白,沉积的血小板，积聚的白细胞和陷入的红细胞组成。
[0003]尿激敏作为一种溶血栓药物，在静脉滴注后，直接作用于内源性纤维蛋白溶解系统能催化裂解纤溶酶原成纤溶酶，后者不仅能降解纤维蛋白凝块，亦能降解血循环中的纤维蛋白原、凝血因子
Ⅴ
和凝血因子
Ⅷ
等，从而发挥溶栓作用。但单纯的尿激敏存在血栓靶向性差的缺点。
[0004]中性粒细胞(neutrophils，NEs)是血液中数量最多的免疫白细胞，是急性炎症的主要反应细胞。中性粒细胞是天然的优良的药物载体。目前，利用中性粒细胞作为药物载体的应用较少，且大部分用于炎症或者肿瘤靶向治疗的药物载体。
[0005]近年来研究发现，中性粒细胞是血栓形成和发展的关键元素，且具有血栓主动靶向性。因此，中性粒细胞是优良的溶栓药物载体。但是，目前没有利用中性粒细胞作为溶栓药物载体，构建中性粒细胞递药系统，根据中性粒细胞的炎症趋化作用靶向血栓部位，受激活形成胞外诱捕网进行药物的定点释放，从而精准治疗血栓的研究应用。

技术实现思路

[0006]为了解决溶栓药物尿激酶的血栓靶向性差的问题，本专利技术拟构建尿素酶驱动中性粒细胞递药系统，将溶栓药物尿激酶精准靶向递送至血栓形成部位，并进行安全、高效溶栓。
[0007]本专利技术提出一种尿素酶驱动中性粒细胞递药系统的合成方法，包括以下步骤：
[0008]S1，将尿素酶(urease)溶液与磺基NHS生物素(sulfo
‑
NHS
‑
Biotin)溶液混合发生反应，得到尿素酶
‑
生物素(Urease
‑
Biotin)；
[0009]S2，使用左旋聚赖氨酸(PLL)溶液包被培养器皿，将中性粒细胞(neutrophils)溶液加入培养器皿中，离心使得中性粒细胞旋转至左旋聚赖氨酸表面，去除上清液，依次加入磺基NHS生物素溶液、链霉亲和素(streptavidin)溶液和步骤S1合成的尿素酶
‑
生物素进行细胞孵育，得到尿素酶修饰的中性粒细胞，所述尿素酶修饰的中性粒细胞固定在所述左旋聚赖氨酸表面；
[0010]S3，将所述尿素酶修饰的中性粒细胞从所述左旋聚赖氨酸表面分离出来，得到所述尿素酶驱动中性粒细胞递药系统。
[0011]作为本专利技术的尿素酶驱动中性粒细胞递药系统的合成方法的进一步改进，步骤S1中：尿素酶溶液的体积为1mL、浓度为1mg/mL，磺基NHS生物素溶液的体积为1mL、浓度为166μ
M。
[0012]作为本专利技术的尿素酶驱动中性粒细胞递药系统的合成方法的进一步改进，步骤S1具体为：
[0013]将尿素酶溶液与磺基NHS生物素溶液混合，在0～10℃中搅拌反应10～60min，将反应后的液体进行透析得到所述尿素酶
‑
生物素。
[0014]作为本专利技术的尿素酶驱动中性粒细胞递药系统的合成方法的进一步改进，步骤S1中，所述透析的过程为，用1kDa的透析袋装载反应后的液体，并浸入磷酸缓冲盐溶液中8～16h。
[0015]作为本专利技术的尿素酶驱动中性粒细胞递药系统的合成方法的进一步改进，步骤S1中，在透析后，还将得到的所述尿素酶
‑
生物素分散在磷酸缓冲盐溶液中，于4℃中保存。
[0016]作为本专利技术的尿素酶驱动中性粒细胞递药系统的合成方法的进一步改进，步骤S2中：加入的所述中性粒细胞溶液的体积为400μL，加入的所述磺基NHS生物素溶液的浓度为166μM、体积为500μL，加入的所述链霉亲和素溶液的浓度为166μM、体积为500μL，加入的所述尿素酶
‑
生物素的体积为500μL。
[0017]作为本专利技术的尿素酶驱动中性粒细胞递药系统的合成方法的进一步改进，步骤S2中，所述依次加入磺基NHS生物素溶液、链霉亲和素溶液和步骤S1合成的尿素酶
‑
生物素进行细胞孵育，具体为：
[0018]在所述培养器皿中，先加入磺基NHS生物素溶液于36～37.5℃中培养0.5～1.5h，再加入链霉亲和素溶液于36～37.5℃中培养0.5～1.5h，最后加入尿素酶
‑
生物素于36～37.5℃中培养0.5～1.5h。
[0019]作为本专利技术的尿素酶驱动中性粒细胞递药系统的合成方法的进一步改进，步骤S3具体为：
[0020]用移液管缓慢反复地吹打，将所述尿素酶修饰的中性粒细胞从所述左旋聚赖氨酸表面分离，然后使用磷酸缓冲盐溶液清洗所述尿素酶修饰的中性粒细胞两次，得到所述尿素酶驱动中性粒细胞递药系统。
[0021]作为本专利技术的尿素酶驱动中性粒细胞递药系统的合成方法的进一步改进，步骤S3还包括：
[0022]将得到的所述尿素酶驱动中性粒细胞递药系统悬浮在含青链霉素的培养液中，置于培养箱中继续培养。
[0023]本专利技术还提出一种尿素酶驱动中性粒细胞递药系统，根据以上所述的合成方法所制备得到，在所述递药系统中，所述尿素酶固定在所述中性粒细胞的一侧。
[0024]作为本专利技术的尿素酶驱动中性粒细胞递药系统的进一步改进，所述递药系统还包括纳米银和尿激敏，所述尿激敏负载在所述纳米银上，所述纳米银和所述尿激敏设置于所述中性粒细胞之中。
[0025]本专利技术的有益效果是：
[0026](1)本专利技术采用中性粒细胞作为溶栓酶载体，主动靶向血栓部位，中性粒细胞可在血栓部位炎症信号刺激下迅速产生胞外诱捕网(NETs)并释放溶栓酶，从而起到高效溶栓的作用。该溶栓酶可以利用银纳米表面负载尿激酶形成高效的“纳米溶栓酶(Ag
‑
UK)”。
[0027](2)为加快中性粒细胞向血栓部位的靶向速率，本专利技术还利用生物素/链霉亲和素
特异性结合的原理，在中性粒细胞(NEs)表面修饰尿素酶驱动马达UBSB(urease
‑
biotin
‑
streptavidin
‑
biotin)或者是尿素酶(urease)，将尿素酶固定在中性粒细胞一侧，得到UBSB
‑
NEs或Urease
‑
NEs。只存在于细胞一侧的尿素酶迅速催化分解血液中大量存在的尿素，产生二氧化碳和氨气，从而以“喷气式马达”的方式反向推进中性粒细胞运动。
[0028](3)将尿素酶驱动中性粒细胞递药系统UBSB
‑
NEs或Urease
‑
NEs(可以携带Ag
‑
UK)静脉给药进入血管后，在尿素本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种尿素酶驱动中性粒细胞递药系统的合成方法，其特征在于，包括以下步骤：S1，将尿素酶溶液与磺基NHS生物素溶液混合发生反应，得到尿素酶
‑
生物素；S2，使用左旋聚赖氨酸溶液包被培养器皿，将中性粒细胞溶液加入培养器皿中，离心使得中性粒细胞旋转至左旋聚赖氨酸表面，去除上清液，依次加入磺基NHS生物素溶液、链霉亲和素溶液和步骤S1合成的尿素酶
‑
生物素进行细胞孵育，得到尿素酶修饰的中性粒细胞，所述尿素酶修饰的中性粒细胞固定在所述左旋聚赖氨酸表面；S3，将所述尿素酶修饰的中性粒细胞从所述左旋聚赖氨酸表面分离出来，得到所述尿素酶驱动中性粒细胞递药系统。2.根据权利要求1所述的尿素酶驱动中性粒细胞递药系统的合成方法，其特征在于，步骤S1中：尿素酶溶液的体积为1mL、浓度为1mg/mL，磺基NHS生物素溶液的体积为1mL、浓度为166μM。3.根据权利要求1所述的尿素酶驱动中性粒细胞递药系统的合成方法，其特征在于，步骤S1具体为：将尿素酶溶液与磺基NHS生物素溶液混合，在0～10℃中搅拌反应10～60min，将反应后的液体进行透析得到所述尿素酶
‑
生物素。4.根据权利要求3所述的尿素酶驱动中性粒细胞递药系统的合成方法，其特征在于，步骤S1中，所述透析的过程为，用1kDa的透析袋装载反应后的液体，并浸入磷酸缓冲盐溶液中8～16h。5.根据权利要求3或4所述的尿素酶驱动中性粒细胞递药系统的合成方法，其特征在于，步骤S1中，在透析后，还将得到的所述尿素酶
‑
生物素分散在磷酸缓冲盐溶液中，于4℃中保存。6.根...

【专利技术属性】
技术研发人员：桑芒芒，郑锦荣，王焱，
申请(专利权)人：厦门大学附属心血管病医院，
类型：发明
国别省市：