一种多功能化学交联剂及其制备方法和应用技术

本发明专利技术涉及一种多功能的化学交联剂及其制备方法和应用，属于有机合成技术领域。其化学结构式为：本发明专利技术化学交联剂具有以下功能特点：富集功能；报告离子功能；同位素标记功能；双琥珀酰亚胺酯反应活性基团；不同的碳链长度以及具有好的水溶性及细胞透膜能力。本发明专利技术化学交联剂应用于蛋白质组学领域，为实现细胞内原位蛋白复合物的规模化分析、细胞内亚细胞器蛋白质复合物规模化分析、细胞内原位目标蛋白质复合物分析、蛋白质复合物的空间结构解析、蛋白质

【技术实现步骤摘要】
一种多功能化学交联剂及其制备方法和应用


[0001]本专利技术涉及一种多功能的化学交联剂及其制备方法和应用。本专利技术交联剂具有三甲基哌啶基富集单元、三甲基哌啶基报告离子单元、
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C同位素标记、琥珀酰亚胺酯反应活性基团以及不同的碳链长度。该专利技术属于有机合成


技术介绍

[0002]蛋白质作为生命活动的执行者，并不是孤立存在的，而是与其他蛋白质发生相互作用形成蛋白质复合物，共同发挥其生物功能。蛋白质复合物组装的高维度信号转导网络调控着生物体的各项生命进程(Curr.Opin. Biotechnol.,2020,63,48；Anal.Chem.,2018,90,144；Trends Biochem.Sci., 2018,43,157.)。因此，蛋白质复合物的研究将极大地促进人们对蛋白质功能的认知，进一步阐释各种复杂生命现象的本质，促进重大疾病潜在药物靶标或诊断标志物的发现(Nat.Commun.,2017,8,15473；Natl.Acad.Sci.U.S. A.,2020,117,4088)。
[0003]化学交联质谱技术是近年来研究蛋白质复合物构象及其相互作用的新兴技术(Curr.Opin.Biotechnol.,2020,63,48；Anal.Chem.,2018,90,144； Trends Biochem.Sci.,2018,43,157.)。它是利用一种化学交联剂将空间距离足够接近的蛋白质内/间的氨基酸以共价键形式连接起来，结合基于质谱技术的自下而上的蛋白质组学策略，实现蛋白质复合物的精准解析。该技术具有独特的优势：第一，适用于各种复杂的生物样品，如全细胞裂解液(Nat. Commun.,2017,8,15473；Mol.Syst.Biol.,2017,13,936)、亚细胞器(Proc. Natl.Acad.Sci.U.S.A.,2017,114,1732；Mol.Cell Proteomics,2017,17, 216.)、完整细胞(J.Am.Soc.Mass.Spectrom.,2019,31,190；Cell Chem.Biol., 2016,23,716.)、生物组织(Cell Syst.,2018,6,136；J.Proteome Res.,2018,17, 3195.)等。结合高通量、高灵敏质谱的优势，实现蛋白质复合物规模化的解析；第二，提供蛋白质间相互作用的界面位点信息，进而推断蛋白质复合物中的作用关系；第三，原位解析生理条件下蛋白质复合物的结构，获得更真实的蛋白质复合物信息；第四，结合定量蛋白质组学，实现蛋白质复合物的动态结构分析。
[0004]化学交联剂是整个化学交联质谱技术的核心要素。针对特定的生物样品，研究人员需要选择最佳的化学交联试剂，并采用与之相应的样品处理方法、质谱数据采集方法、数据处理及可视化工具等，实现化学交联质谱技术的成功应用。经典的化学交联剂只有两个反应活性基团和连接臂组成，如DSS、DSG、EGS等。面对复杂的生物样品(如全细胞裂解液、完整细胞等)，由于背景干扰大、交联肽丰度低等原因，导致交联肽鉴定困难、数据解析假阳性高。为了实现复杂生物样品中的蛋白质复合物结构及其相互作用规模化精准解析，各种功能的化学交联剂被开发，如可富集、质谱可碎裂、同位素标记、具有报告离子等，以提高交联肽的鉴定准确度、质谱数据解析的通量。开发多功能化学交联剂，更好地满足更复杂生物样品的应用需求，是化学交联剂的发展趋势。

技术实现思路

[0005]基于上述化学交联剂的研究现状及设计原则，本专利技术设计并合成了一种多功能的化学交联剂。本专利技术交联剂具有三甲基哌啶基富集单元，通过与抗TMT琼脂糖球特异性结合，实现交联肽段的富集，提高交联肽在质谱中的信号强度，降低常规肽段背景干扰，实现交联肽高通量、高灵敏度分析；三甲基哌啶基在质谱中发生高效碎裂，产生特定的报告离子信号峰，实现交联肽的高可信度鉴定；三甲基哌啶基引入
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C同位素标记，实现化学交联质谱与定量蛋白质组学技术结合，研究蛋白质复合物结构及其相互作用动态变化信息；具有琥珀酰亚胺酯反应活性基团，生理条件下与蛋白质赖氨酸残基末端或N端氨基发生酰胺化反应，实现蛋白质复合物空间邻近的赖氨酸的化学交联；反应活性基团之间具有不同的碳链长度，实现不同空间间距的赖氨酸残基的共价结合，进一步提高蛋白质化学交联的深度，捕获更多的蛋白质复合物结构及其相互作用位点信息；具有好的水溶性及细胞透膜能力，实现真实的细胞内原位蛋白质复合物结构及相互作用信息的解析。
[0006]本专利技术提供的多功能交联剂，结构如下所示：
[0007][0008]其中，n为不同的碳链长度值，取值1,2,3,4,5；“*”为
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C的标记位置，标记
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C数目为一个或两个。
[0009]具体包含5种结构，如下所示：
[0010]碳链长度值n取值为1的交联剂TMTC7NHS结构：
[0011][0012]“*”为
13
C的标记位置，标记
13
C数目为一个或两个。
[0013]碳链长度值n取值为2的交联剂TMTC9NHS结构：
[0014][0015]“*”为
13
C的标记位置，标记
13
C数目为一个或两个。
[0016]碳链长度值n取值为3的交联剂TMTC11NHS结构：
[0017][0018]“*”为
13
C的标记位置，标记
13
C数目为一个或两个。
[0019]碳链长度值n取值为4的交联剂TMTC13NHS结构：
[0020][0021]“*”为
13
C的标记位置，标记
13
C数目为一个或两个。
[0022]碳链长度值n取值为5的交联剂TMTC15NHS结构：
[0023][0024]“*”为
13
C的标记位置，标记
13
C数目为一个或两个。
[0025]本专利技术提供了交联剂的制备方法，具体步骤如下(反应式如下所示)：
[0026]第一步，将反应物3
‑
溴丙酸溶于NaOH溶液中，调pH为13
‑
14，降温至0
‑
5℃。将起始原料2,6
‑
二甲基哌啶滴加至反应液中，2,6
‑
二甲基哌啶与 3
‑
溴丙酸摩尔比为1：(1.5
‑
2.0)。滴毕，反应液升温至25
‑
30℃，继续搅拌 3
‑
4天。反应完毕，反应液调pH为1
‑
2，加入二氯甲烷萃取产物。除去二氯甲烷，粗产物以二氯甲烷：甲醇＝20:1(体积比)为流动性，经柱层析进一步纯化，即制得2,6
‑
二甲基哌啶基乙酸(化合物1)。
[0027]第二步，将化合物1、1.2
‑
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【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种多功能化学交联剂，其化学结构式为：其中，n为不同的碳链长度值，取值1、2、3、4或5；“*”为
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C的标记位置，标记数目为一个或两个。2.一种权利要求1所述的化学交联剂的制备方法，其特征在于，具体过程如下：步骤一，2,6
‑
二甲基哌啶、3
‑
溴丙酸为起始原料，在氢氧化钠水溶液中发生亲核取代反应，离去一分子溴化氢，制备2,6
‑
二甲基哌啶基乙酸(化合物1)；步骤二，化合物1为反应原料，1
‑
(3
‑
二甲氨基丙基)
‑3‑
乙基碳二亚胺盐酸盐(以下简称EDC)为缩合剂、二甲基亚砜(以下简称DMSO)为反应溶剂，与N
‑
羟基丁二酰亚胺(以下简称NHS)发生酯化反应，制备活性酯；以三乙胺为有机碱，与3
‑
氨基丙酸发生酰胺化反应，制备2,6
‑
二甲哌啶基乙酰丙酸(化合物2)；步骤三，化合物2为原料，EDC为缩合剂、1
‑
羟基苯并三氮唑(以下简称HoBt)为消旋剂，二异丙基乙基胺(以下简称DIEA)为有机碱，N,N
‑
二甲基甲酰胺(以下简称DMF)为反应溶剂，与不同碳链长度的二甲酯氨基盐酸盐发生酰胺化反应，制备不同碳链长度的2,6
‑
二甲哌啶基二甲酯(化合物3)，其中用n表示不同的碳链长度值，取值1、2、3、4或5；步骤四，化合物3为原料，四氢呋喃(以下简称THF)为有机溶剂，在氢氧化钠水溶液中发生水解反应，得到羧酸钠盐；再用浓盐酸调pH为2
‑
3，即制备不同碳链长度的2,6
‑
二甲哌啶基二羧酸(化合物4)，其中用n表示不同的碳链长度值，取值1、2、3、4或5；步骤五，化合物4为原料，EDC为缩合剂、DMSO为反应溶剂，与NHS发生酯化反应，制备目标化学交联剂TMTC(2n+5)NHS，其中用n表示不同的碳链长度值，取值1、2、3、4或5。3.根据权利要求2所述的化学交联剂的制备方法，其特征在于：步骤一中将原料3
‑
溴丙酸溶于pH为13
‑
14的氢氧化钠溶液中，降温至0
‑
5℃；将原料2,6
‑
二甲基哌啶滴加至反应液中，2,6
‑
二甲基哌啶与3
‑
溴丙酸摩尔比为1：(1.5
‑
2.0)；滴毕，反应液升温至25
‑
30℃，继续搅拌3
‑
4天；反应完毕，反应液用质量浓度30
‑
36％的浓盐酸调pH为1
‑
2，加入二氯甲烷萃取产物；除去二氯甲烷，粗产物以二氯甲烷：甲醇＝(10
‑
20):1(体积比)为流动相，经柱层析进一步纯化，即制得2,6
‑
二甲基哌啶基乙酸(化合物1)。4.根据权利要求2所述的化学交联剂的制备方法，其特征在于：步骤二中将化合物1、相...

【专利技术属性】
技术研发人员：张丽华，高航，赵群，赵宝锋，张玉奎，
申请(专利权)人：中国科学院大连化学物理研究所，
类型：发明
国别省市：