IGFBP7肌肉组织特异性敲除小鼠动物模型及其构建方法技术

本发明专利技术涉及IGFBP7肌肉组织特异性敲除小鼠动物模型及其构建方法。采用本发明专利技术所述方法构建得到的小鼠模型用于探究IGFBP7基因在小鼠肌肉发育中的重要功能和分子机制。所述小鼠模型敲除了IGFBP7基因中第三外显子，先后通过打靶载体的构建和ES打靶，构建F0嵌合体小鼠，F0嵌合体小鼠与组织特异性Cre工具鼠杂交获得F1代敲除杂合子，最终F1代杂合子近交获得IGFBP7基因敲除纯合子小鼠。本发明专利技术对于IGFBP7基因功能的研究和在体验证提供了良好的基础，对完善肌肉发育调控网络具有重大意义。对完善肌肉发育调控网络具有重大意义。对完善肌肉发育调控网络具有重大意义。

【技术实现步骤摘要】
IGFBP7肌肉组织特异性敲除小鼠动物模型及其构建方法


[0001]本专利技术涉及遗传学和生物
，涉及IGFBP7肌肉组织特异性敲除小鼠动物模型，以及该基因敲除小鼠模型的构建方法。

技术介绍

[0002]肌肉的生长和发育直接影响着机体的生命活动，此外，其与畜禽生产中的产肉性状直接相关。因此，阐明肌肉生长发育关键候选基因作用分子机制，丰富肌肉生长发育的分子调控网络，一方面可以为人类肌肉生长发育疾病提供重要的治疗靶点，另一方面可加快畜禽分子育种的进展。
[0003]胰岛素样生长因子结合蛋白
‑
7(IGFBP7)又称mac25和IGFPB
‑
rP1，是IGFBP家族的分泌蛋白。自从发现IGFBP7在正常柔脑膜细胞和脑膜瘤中的表达差异后，IGFBP7在各种癌症中的潜在作用得到了广泛的研究。目前已经证实，IGFBP7在癌细胞中的表达经常由于该基因的DNA甲基化而下调，当其高水平表达时，会抑制肿瘤的生长。然而，IGFBP7在正常组织发育中的作用知之甚少。IGFBP7可以绑定胰岛素样生长因子1受体(IGF1R)，可阻止受体与胰岛素样生长因子1(IGF
‑
1)的结合和阻断IGF信号通路的激活。然而，人们对IGFBP7在肌肉生物学中的作用知之甚少。

技术实现思路

[0004]本专利技术采用TurboKnockout技术通过构建带有loxP位点的小鼠，在与肌肉组织特异性Cre工具鼠杂交后特异性敲除IGFBP7基因第3号外显子，从而实现IGFBP7肌肉组织特异性敲除，用于研究IGFBP7基因在肌肉生长发育中的重要作用和分子机制。
[0005]本专利技术的第一方面提供IGFBP7肌肉组织特异性敲除小鼠动物模型的构建方法，包括以下步骤：
[0006](1)构建打靶载体，在小鼠IGFBP7基因第3号外显子两侧插入两个同向的loxP位点，敲除小鼠IGFBP7基因的第3号外显子；
[0007]具体地，打靶载体包括：loxP序列、SDA自删除位点、Neo正筛选标记、DTA负筛选标记、靶向IGFBP7第二内含子的左同源臂、靶向IGFBP7第三内含子的右同源臂和IGFBP7第3号外显子条件性敲除区域；在IGFBP7基因内含子2和内含子3各取一段序列作为5
’
同源臂和3
’
同源臂，两臂之间插入正筛选标记、自删除位点和cKO区域，同时在5
’
同源臂5
’
端连接负筛选标记表达元件。
[0008]IGFBP7基因(NCBI reference sequence：NC_000071.6)位于小鼠第5号染色体，总大小为58806bp，目前共鉴定出6个外显子，2个转录本，分别为NM_008048.3(编码282个氨基酸)和NM_001159518.1(编码313个氨基酸)。
[0009]打靶载体的构建包括以下步骤：
[0010]①
分别获取C57BL/6N小鼠IGFBP7基因序列的第二内含子、第三内含子序列，将第二内含子上的一段1983bp序列作为左同源臂，将第三内含子上的一段序列作为右2060bp序
列作为右同源臂，以BAC clone RP23
‑
392E和RP23
‑
473O24为模板使用高保真酶通过PCR获得；
[0011]②
获取C57BL/6N小鼠IGFBP7基因序列第3号外显子，通过PCR扩增IGFBP7基因第3号外显子，在其两侧连接两个同向的loxP位点，并与左同源臂相连；
[0012]③
通过PCR扩增Neo筛选标记和SDA自删除点，将Neo筛选标记连接到两个自删除位点间，5
’
端与右loxP位点相连，3
’
端与右同源臂相连；正筛选标记表达元件长度为3794bp；
[0013]④
通过PCR扩增DTA负筛选标记，连接到5
’
同源臂5
’
端。
[0014](2)打靶载体电转至ES细胞，通过正负筛选挑选和鉴定阳性ES细胞；用于电转的ES细胞来源于C57BL/6N系小鼠；
[0015]具体地，通过NotI酶切IGFBP7基因敲除打靶载体，然后回收线性化载体，按照标准电转染程序将线性化载体电转至C57BL/6N胚胎干细胞；转染后的胚胎干细胞在电转24小时后进行G418药物筛选，药物筛选所用的浓度为200ug/ml；通过PCR对阳性克隆进行鉴定，进一步通过Southern blot鉴定PCR鉴定筛选到的阳性克隆；Southern杂交所用的限制性内切酶为MfeI和EcoNI，条带大小分别为7.6kb和10.4kb。
[0016](3)显微注射和胚胎移植获得IGFBP7基因编辑小鼠；
[0017]具体地，将鉴定阳性的胚胎干细胞克隆注射到C57BL/6N胚胎中，再植入假孕雌性体内，繁育获得F0代小鼠；提取F0代小鼠尾部DNA，根据本专利技术第一个方面所述方法中的鉴定引物进行PCR鉴定，鉴定是否为基因编辑杂合小鼠；
[0018]阳性ES细胞鉴定所用引物序列和产物大小为：
[0019]①
鉴定3
’
同源臂的引物:
[0020]F1:5
’‑
GGCTGGTAAGGGATATTTGCCTG
‑3’
(SEQ ID NO.1)，R1:5
’‑
TTCAGGTTTGTCCCACGTCTC
‑3’
(SEQ ID NO.2)，阳性克隆产物大小为2313bp，野生型没有条带；
[0021]②
鉴定loxP位点的引物：
[0022]F2:5
’‑
ACTGCTTTGAGCATTTGCCTTC
‑
3(SEQ ID NO.3)，
[0023]R2:5
’‑
GGTCAGTGCTAACAACCATTCCT
‑3’
(SEQ ID NO.4)，阳性克隆产物大小为251bp，野生型为215bp；
[0024]③
鉴定Neo筛选标记的引物：
[0025]F1:5
’‑
GGCTGGTAAGGGATATTTGCCTG
‑3’
，
[0026]R3:5
’‑
TTACTTCATAGCTTCCTGCCACC
‑3’
(SEQ ID NO.5)，阳性克隆产物大小为264bp，野生型没有条带。
[0027](4)与肌肉组织特异性表达Cre工具鼠杂交和杂合子近交获得IGFBP7肌肉组织特异性敲除纯合小鼠；所用的组织特异性表达Cre工具鼠，重组酶Cre基因由Myf5启动子在肌肉组织中特异性启动表达；
[0028]具体地，将步骤(3)中性成熟的阳性F0代小鼠与Myf5
‑
cre工具鼠进行杂交获得F1代小鼠，通过PCR扩增本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.IGFBP7肌肉组织特异性敲除小鼠动物模型的构建方法，其特征在于，包括：(1)构建打靶载体，在小鼠IGFBP7基因第3号外显子两侧插入两个同向的loxP位点；(2)打靶载体电转至ES细胞，通过正负筛选挑选和鉴定阳性ES细胞；(3)显微注射和胚胎移植获得IGFBP7基因编辑小鼠；(4)与肌肉组织特异性表达Cre工具鼠杂交和杂合子近交获得IGFBP7肌肉组织特异性敲除纯合小鼠。2.根据权利要求1所述的构建方法，其特征在于，敲除小鼠IGFBP7基因的第3号外显子。3.根据权利要求1所述的构建方法，其特征在于，所述打靶载体包括：loxP序列、SDA自删除位点、Neo正筛选标记、DTA负筛选标记、靶向IGFBP7第二内含子的左同源臂、靶向IGFBP7第三内含子的右同源臂和IGFBP7第3号外显子条件性敲除区域。4.根据权利要求1所述的构建方法，其特征在于，用于电转的ES细胞来源于C57BL/6N系小鼠。5.根据权利要求1所述的构建方法，其特征在于，打靶载体的构建步骤包括：(1)C57BL/6N小鼠IGFBP7基因序列的第二内含子的一段序列作为左同源臂、第三内含子序列的一段序列作为右同源臂；(2)获取C57BL/6N小鼠IGFBP7基因序列第3号外显子，通过PCR扩增IGFBP7基因第3号外显子，在其两侧连接两个同向的loxP位点，并与左同源臂相连；(3)通过PCR扩增Neo筛选标记和SDA自删除点，将Neo筛选标记连接到两个自删除位点间，5
’
端与右loxP位点相连，3
’
端与右同源臂相连；(4)通过PCR扩增DTA负筛选标记，连接到5
’
同源臂5
’
端。6.根据权利要求1所述的构建方法，其特征在于，阳性ES细胞鉴定所用引物序列和产物大小为：(1)鉴定3
’
同源臂的...

【专利技术属性】
技术研发人员：方美英，雒亚彪，产舒恒，薛明明，肖莲梅，白莹，许桥，汤启国，
申请(专利权)人：中国农业大学，
类型：发明
国别省市：