一种牙髓间充质干细胞的冻存方法技术

本发明专利技术公开了一种牙髓间充质干细胞的冻存方法，包括以下步骤：(1)向培养基中加入海藻糖、羟乙基淀粉、芒果苷得保存液，将待保存的牙髓间充质干细胞采用上述保存液重悬，分装在冻存管中，程序降温至2

【技术实现步骤摘要】
一种牙髓间充质干细胞的冻存方法


[0001]本专利技术涉及干细胞领域，尤其涉及一种牙髓间充质干细胞的冻存方法。

技术介绍

[0002]人间充质干细胞(human Mesenchymal Stem Cells,hMSCs)是一类特殊的间充质干细胞，其具有组织修复、免疫调节和多向分化的潜能，已广泛应用于多种疾病的临床治疗研究。
[0003]由牙髓组织中分离出的成纤维状细胞就称为牙髓间充质干细胞，牙髓组织位于在牙齿内部的牙髓腔内。牙髓间充质干细胞属于多功能的成体干细胞，牙髓间充质干细胞具有多向分化能力，能够分化为骨、脂肪和血管内皮等组织细胞。牙髓间充质干细胞能够用于牙髓、牙体、牙冠的组织修复与再生，还可以用于颅骨、颌骨及面骨的损伤修复。牙髓间充质干细胞的增殖能力强、组织相容性高、储存方便，给现代医学带来极大的便利。
[0004]牙髓中干细胞含量较低，必须在体外进行扩增，以获得足够的细胞数量来满足应用需求。由于体外扩增需要一定的时间，不能做到立即取用，因此做好牙髓间充质干细胞的保存工作显得特别重要。
[0005]对于分离得到的种子细胞或者经扩增培养得到的牙髓间充质干细胞如不及时使用，就需要选择合适的条件保存起来，待需要时可快速恢复细胞活性。常见的保存方法为在液氮中冻存，在液氮中冻存可大大延长牙髓间充质干细胞的保存时间，但是液氮保存液存在一定的问题，如经冻存后的细胞存活率低，增殖活性差等，因此有必要研究一种牙髓间充干细胞的冻存方法，在保证细胞活性的情况下，延长保存时间。

技术实现思路

[0006]为了克服现有技术的不足，本专利技术的目的在于提供一种牙髓间充质干细胞的冻存方法，有效保证牙髓间充质干细胞冻存后的活性。
[0007]本专利技术的目的采用如下技术方案实现：
[0008]一种牙髓间充质干细胞的冻存方法，包括以下步骤：
[0009](1)向培养基中加入海藻糖、羟乙基淀粉、芒果苷得保存液，将待保存的牙髓间充质干细胞采用上述保存液重悬，分装在冻存管中，程序降温至2
‑
6℃；
[0010](2)向培养基中加入月见草油、醉椒素降温至2
‑
6℃，然后加入步骤(1)的冻存管中，程序降温至
‑
80℃，在
‑
80℃下保存8
‑
12h；
[0011](3)将步骤(2)的细胞转移至液氮中冻存，即完成。
[0012]进一步地，所述培养基为DMEM/F12培养基。
[0013]进一步地，步骤(1)中海藻糖、羟乙基淀粉、芒果苷在培养基中的浓度为：海藻糖20
‑
30μg/mL、羟乙基淀粉10
‑
15μg/mL、芒果苷5
‑
10μg/mL。
[0014]进一步地，步骤(1)中海藻糖、羟乙基淀粉、芒果苷在培养基中的浓度为：海藻糖25μg/mL、羟乙基淀粉12μg/mL、芒果苷8μg/mL。
[0015]进一步地，步骤(2)中月见草油、醉椒素在培养基中的终浓度为：月见草油1
‑
5ng/mL、醉椒素8
‑
12ng/mL。
[0016]进一步地，步骤(2)中月见草油、醉椒素在培养基中的终浓度为：月见草油3ng/mL、醉椒素10ng/mL。
[0017]进一步地，步骤(1)中牙髓间充质干细胞在冻存管中的密度为5
‑9×
106个/mL。
[0018]进一步地，步骤(2)中添加的培养基的体积和冻存管中的培养基的体积比为0.3
‑
0.5:1。
[0019]进一步地，步骤(1)中程序降温过程为：以1
‑
3℃/min降温至2
‑
6℃。
[0020]进一步地，步骤(2)的程序降温过程为：2
‑
6℃等待1
‑
2min，然后以3
‑
5℃/min降温至
‑
20～
‑
30℃，以10
‑
15℃/min降温至
‑
80℃。
[0021]相比现有技术，本专利技术的有益效果在于：本专利技术提供一种牙髓间充质干细胞的冻存方法，向培养基中加入海藻糖、羟乙基淀粉和芒果苷，重悬细胞后先降温至2
‑
6℃，然后再加入添加月见草油和醉椒素的培养基，继续程序降温至
‑
80℃，最后转移至液氮中保存。本专利技术的冻存方法能有效保证牙髓间充质干细胞的活率，冻存后的细胞仍具有较好的增殖活性，保证牙髓间充质干细胞的应用效果。
附图说明
[0022]图1为本专利技术实施例1至实施例3，对比例1至对比例4中牙髓间充质干细胞在冻存6个月后细胞的活率；
[0023]图2为本专利技术实施例1至实施例3，对比例1至对比例4中牙髓间充质干细胞复苏后的增殖活性检测结果。
具体实施方式
[0024]下面，结合附图以及具体实施方式，对本专利技术做进一步描述，需要说明的是，在不相冲突的前提下，以下描述的各实施例之间或各技术特征之间可以任意组合形成新的实施例。
[0025]本专利技术所用的牙髓间充质干细胞通过以下方法制备得到：
[0026](1)将临床拔除的智齿清洗干净后取出牙髓组织
[0027](2)将步骤(1)的牙髓组织用手术剪剪碎后加入DMEM完全培养基，在6cm培养皿中进行原代培养，当细胞生长至融合度80
‑
90％后，用0.25％胰酶消化，以1:3的比例进行传代培养，收集传代培养得到的P3代细胞进行冻存实验。
[0028]实施例1
[0029]一种牙髓间充质干细胞的冻存方法，包括以下步骤：
[0030](1)向DMEM/F12培养基中加入海藻糖、羟乙基淀粉、芒果苷得保存液，海藻糖、羟乙基淀粉、芒果苷在培养基中的浓度为：海藻糖25μg/mL、羟乙基淀粉12μg/mL、芒果苷8μg/mL，将待保存的P3代牙髓间充质干细胞采用上述保存液重悬，分装在冻存管中，每管1mL，牙髓间充质干细胞在冻存管中的密度为7
×
106个/mL，以2℃/min程序降温至4℃；
[0031](2)向DMEM/F12培养基中加入月见草油、醉椒素降温至4℃，取0.4mL上述培养基加入步骤(1)的冻存管中，月见草油、醉椒素在培养基中的终浓度为：月见草油3ng/mL、醉椒素
10ng/mL，程序降温过程为：4℃等待1min，然后以4℃/min降温至
‑
25℃，以12℃/min降温至
‑
80℃，在
‑
80℃下保存10h；
[0032](3)将步骤(2)的细胞转移至液氮存储罐中冻存，即完成。
[0033]实施例2
[0034]一种牙髓间充质干细胞的冻存方法，包括以下步骤：
[0035](1)向DMEM/F12培养基中加入海藻糖、羟乙基淀粉、芒果苷得保存液，海藻本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种牙髓间充质干细胞的冻存方法，其特征在于，包括以下步骤：(1)向培养基中加入海藻糖、羟乙基淀粉、芒果苷得保存液，将待保存的牙髓间充质干细胞采用上述保存液重悬，分装在冻存管中，程序降温至2
‑
6℃；(2)向培养基中加入月见草油、醉椒素降温至2
‑
6℃，然后加入步骤(1)的冻存管中，程序降温至
‑
80℃，在
‑
80℃下保存8
‑
12h；(3)将步骤(2)的细胞转移至液氮中冻存，即完成。2.根据权利要求1所述牙髓间充质干细胞的冻存方法，其特征在于，所述培养基为DMEM/F12培养基。3.根据权利要求1所述牙髓间充质干细胞的冻存方法，其特征在于，步骤(1)中海藻糖、羟乙基淀粉、芒果苷在培养基中的浓度为：海藻糖20
‑
30μg/mL、羟乙基淀粉10
‑
15μg/mL、芒果苷5
‑
10μg/mL。4.根据权利要求3所述牙髓间充质干细胞的冻存方法，其特征在于，步骤(1)中海藻糖、羟乙基淀粉、芒果苷在培养基中的浓度为：海藻糖25μg/mL、羟乙基淀粉12μg/mL、芒果苷12μg/mL。5.根据权利要求1所述牙髓间充质干细胞的冻存方法，其特征在于，步骤(2)中月见草油、醉椒素在培养基...

【专利技术属性】
技术研发人员：张俊杰，冯燕，
申请(专利权)人：张俊杰，
类型：发明
国别省市：