一种小鼠胚胎干细胞及其制备方法和应用技术

本发明专利技术涉及一种小鼠胚胎干细胞株SXMUe002

【技术实现步骤摘要】
一种小鼠胚胎干细胞及其制备方法和应用


[0001]本专利技术涉及生物
，特别是涉及一种鼠胚胎干细胞及其制备方法和应用。

技术介绍

[0002]血友病是一种X染色体连锁隐性遗传性出血性疾病。F8基因缺陷导致血友病A(hemophilia A，HA)，F9基因缺陷导致血友病B(hemophilia B，HB)，在男性人群中，发病率分别为1/5,000及1/25,000(杨仁池.血友病诊断与治疗中国专家共识(2017年版)[J].中华血液学杂志,2017,38(05):364
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370)。中国是一个人口大国，预计有80,000
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120,000血友病患者，其中约50％为重型。血友病现有的治疗手段仍以凝血因子制品输注的替代治疗为主，对家庭和社会造成极大负担
[2]。此外，长期输注凝血因子导致抑制物的产生使得替代治疗疗效降低甚至无效，研究显示无义突变是凝血因子抑制物产生的高危因素
[3]。故针对无义突变所致的血友病，探索新的廉价的个性化治疗方法并揭示其分子机制具有重要的意义。由于血友病是单基因遗传病,因此对于血友病,基因治疗应该是最理想的方式。而小鼠模型的我们研究各种疾病的良好模型，包括血友病。
[0003]CRISPR/Cas9基因编辑技术的发展为我们构建疾病模型提供了方便，它可以精准的实现目的基因的改造。以往的血友病小鼠模型是敲除F8/F9基因而导致凝血因子合成障碍，但血友病的基因突变种类繁多，这种敲除小鼠模型不能够很好反应血友病具体的基因突变情况。这就需要构建更符合病例条件下的基因突变类型。
[0004]山西医科大学第二医院筛查出一个带有无义突变的血友病B患者(F9.223C ＞T)，Factor IX Gene(F9)Variant Database(http://www.factorix.org/)显示3713 个个案报告中有1094种F9变体，其中无义突变有87种，约占8％。F9 C.223C ＞T有73个患者报导，中国有7例，其中中国大陆5例，中国台湾2例。另一个数据库(https://omim.org/)显示有几千种无义突变与疾病有关。为了更深入研究血友病及无义突变的发病机制及治疗，我们在前期的研究基础中，进一步利用 CRISPR/Cas9技术在小鼠胚胎干细胞上构建到了一株无义突变的(F9 c.223C＞ T)小鼠胚胎干细胞模型。

技术实现思路

[0005]基于此，本专利技术的目的之一在于提供一种小鼠胚胎干细胞株SXMUe002
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1。
[0006]包括如下技术方案：
[0007]一种小鼠胚胎干细胞株SXMUe002
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1，其保藏编号为CGMCC No：23035，于2021年9月28日保藏于国家典型培养物保藏中心。
[0008]所述小鼠胚胎干细胞株具有F9基因发生c.223C＞T无义突变。
[0009]本专利技术的第二目的是提供所述小鼠胚胎干细胞株SXMUe002
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1在制备小鼠血友病细胞模型中的应用
[0010]本专利技术的第三目的是提供一种小鼠血友病模型，其通过嵌合注射上述的小鼠胚胎干细胞株SXMUe002
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1而制备得到。
[0011]本专利技术的第四目的是提供上述的小鼠胚胎干细胞株SXMUe002
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1或上述小鼠血友病模型的应用。
[0012]上述的小鼠胚胎干细胞株SXMUe002
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1或上述小鼠血友病模型在制备、筛选血友病治疗药物中的应用。
[0013]上述的小鼠胚胎干细胞株SXMUe002
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1或上述小鼠血友病模型在制备、筛选血友病治疗药物中的应用在制备血友病检测或分类、和/或治疗或预后监测的试剂中的应用。
[0014]上述的小鼠胚胎干细胞株SXMUe002
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1或上述小鼠血友病模型在研究血友病无义突变发病的分子机制、无义突变的治疗策略中的应用。
[0015]本专利技术的第五目的是提供上述的小鼠胚胎干细胞株SXMUe002
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1的制备方法
[0016]上述小鼠胚胎干细胞株SXMUe002
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1的制备方法，包括如下步骤：
[0017]构建具有SEQ ID NO.43、SEQ ID NO.44、和SEQ ID NO.45所示序列的模板质粒；
[0018]将具有如SEQ ID NO.23和SEQ ID NO.24所示序列的sgRNA构建到px330 质粒中；
[0019]将构建后的px330质粒和所述模板质粒导入E14细胞中，筛选获得小鼠胚胎干细胞株SXMUe002
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1。
[0020]本专利技术所述小鼠胚胎干细胞株SXMUe002
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1，已于2021年9月28日在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心保藏，保藏编号为CGMCC No： 23035。地址为北京市朝阳区北辰西路1号院3号，中国科学院微生物研究所，邮编：100101。
[0021]本专利技术的小鼠胚胎干细胞株SXMUe002
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1具有以下优势：
[0022]1.本专利技术的专利技术人，通过筛选获得了一株人血友病B相关的无义突变的 (F9c.223C＞T)的小鼠胚胎干细胞株SXMUe002
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1。这为血友病无义突变的机制研究、血友病的药物筛选及基因治疗提供了非常重要资源。
[0023]2.所获得的这株小鼠胚胎干细胞株SXMUe002
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1生长繁殖能力及细胞形态与野生型高度相似，其在外显子上没有碱基的缺失及插入，仅仅是一个碱基发生了突变，更接近临床病例。
[0024]3.通过嵌合注射这株所述小鼠胚胎干细胞株SXMUe002
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1，可获得小鼠胚胎干细胞模型，而这是人iPS伦理不允许的，这对于进一步进行血友病无义突变的机制研究、血友病的药物筛选及基因治疗有重大意义。
附图说明
[0025]图1.SXMUe002
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1细胞系的基因模式图。
[0026]图2.SXMUe002
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1细胞系的特征描述：其中A为细胞形态图，比例尺，25μm； B为细胞核型图。
[0027]图3为多能性标志物Nanog及Oct4的细胞免疫染色图，比例尺，50μm。
[0028]图4 SXMUe002
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A<本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种小鼠胚胎干细胞株SXMUe002
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1，其保藏编号为CGMCC No：23035，于2021年9月28日保藏于国家典型培养物保藏中心。2.根据权利要求1所述的小鼠胚胎干细胞株SXMUe002
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1，其特征在于，所述小鼠胚胎干细胞株具有F9基因发生c.223C＞T无义突变。3.权利要求1
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2任一项所述小鼠胚胎干细胞株SXMUe002
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1在制备小鼠血友病细胞模型中的应用。4.一种小鼠血友病模型，其特征在于，通过嵌合注射权利要求1或2所述的小鼠胚胎干细胞株SXMUe002
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1而制备得到。5.权利要求1或2所述的小鼠胚胎干细胞株SXMUe002
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1或权利要求4所述小鼠血友病模型在制备、筛选血友病治疗药物中的应用。6.权利要求1或2所述的小鼠胚胎干细胞株SXMUe002<...

【专利技术属性】
技术研发人员：杨林花，马艳春，王刚，孙雯雯，姚明泽，吴长新，赵丽东，
申请(专利权)人：山西大学，
类型：发明
国别省市：