用于次要等位基因和多态性的鉴定和定量的多重化方法技术

本申请涉及用于次要等位基因和多态性的鉴定和定量的多重化方法。本文提供了用于检测含有次要核酸物质和一种或多种主要核酸物质的混合物的样品中次要核酸物质是否存在的产品和方法，其中次要核酸物质的量(频率或拷贝数)小于主要核酸物质的量。某些方法包括扩增混合物并用链终止剂和与扩增子特异性杂交的延伸引物延伸所得的扩增子，其中针对主要核酸物质特异性的链终止剂具有小于对于次要核酸物质特异性的链终止剂的浓度。使链终止剂的浓度倾向于相对于主要核酸物质特异性链终止剂有利于对于次要核酸物质特异性的链终止剂的高浓度改善了检测在混合物中以低频率或拷贝数存在的次要核酸物质的检测限(灵敏度)。另外，从主要核酸物质扩增子的延伸产物生成的信号可用作阳性对照并且允许相对于混合物中的主要核酸物质对次要核酸物质进行定量。主要核酸物质对次要核酸物质进行定量。主要核酸物质对次要核酸物质进行定量。

【技术实现步骤摘要】
用于次要等位基因和多态性的鉴定和定量的多重化方法
[0001]本申请是中国专利申请号201680013462.4的分案申请。
[0002]相关申请
[0003]本申请要求2016年1月20日提交的题为“用于次要等位基因和多态性的鉴定和定量的多重化方法”，专利技术人为Anders Nygren并且代理人案卷号为AGB
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7001
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PV2的美国临时申请号62/280951的优先权。本申请还要求2015年4月24日提交的题为“用于次要等位基因和多态性的鉴定和定量的多重化方法”，专利技术人为Anders Nygren并且代理人案卷号为AGB
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7001
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PV的美国临时申请号62/152697的优先权。本申请涉及2012年12月18日提交的专利技术人为Martin Beaulieu和Dirk Johannes van den Boom，标题为“用于高水平多重化聚合酶链反应和均匀质量延伸反应的方法”，代理人案卷号为AGB
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2079
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CT2的美国专利申请号13/718,758，其是2011年7月28日提交的专利技术人为Martin Beaulieu和Dirk Johannes van den Boom，标题为“用于高水平多重化聚合酶链反应和均匀质量延伸反应的方法”，代理人案卷号为AGB
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2079
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CT的美国专利申请号13/193,390，现在美国专利号8,349,566的连续申请，其是2004年7月30日提交的专利技术人为Martin Beaulieu和Dirk Johannes van den Boom，标题为“用于高水平多重化聚合酶链反应和均匀质量延伸反应的方法”，代理人案卷号为SEQ
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2079
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UT的美国专利申请号10/903,268，现在美国专利号8,003,317的连续申请，其根据35 U.S.C.
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119(e)要求2003年7月31日提交的Martin Beaulieu和Dirk van den Boom的标题为“用于高水平多重化聚合酶链反应和均匀质量延伸反应的方法”，代理人案卷号为17082
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087P01(P2079)的美国临时申请号60/492,102的优选权。本申请还涉及2012年12月18日提交的专利技术人为Martin Beaulieu和Dirk van den Boom，标题为“用于高水平多重化聚合酶链反应和均匀质量延伸反应的方法”的国际PCT申请号PCT/US2004/024953。这些申请各自的内容通过引用纳入本文，包括文本、表格和附图。


[0004]该技术部分涉及鉴定和/或定量核酸变体，例如，野生型等位基因的突变变体或多态性。

技术介绍

[0005]检测特异性核酸是诊断医学和分子生物学研究的重要工具。核酸试验可以，例如，鉴定宿主对象中的感染性生物体如细菌和病毒，探测正常基因的表达和鉴定突变基因如癌基因，组织移植前针对相容性对组织分型，匹配法医学的组织或血液样品，分析不同物质的基因之间的同源性和鉴定基因变体的等位基因和多态性。这些应用通常需要在含有较大量的非靶(主要(major))核酸物质的核酸样品或混合物中检测和/或鉴定较小量的存在的感兴趣的次要(minor)核酸物质(例如，野生型等位基因的次要等位基因变体，或癌基因)的能力。如果可以多重化方式进行核酸试验，即筛选多种核酸，则可进一步增强这种能力(例如，在效率上)。
[0006]通常可靠且可重复的检测等位基因间的低频率(拷贝数)变体、多态性或其他突变
的现有方法，包括多重化方法，具有小于鉴定低频率变体可能需要的检测灵敏性或检测限(例如，约10％
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15％频率的检测限将无法鉴定低于该范围的突变频率)。较低检测限一般是由于低频率变体检测信号被主要野生型物质的较大检测信号遮蔽。其他方法通过去除“野生型”信号，从而改善低频率变体的检测来克服这一问题。然而，去除野生型信号可能导致难以对核酸样品中变体的相对量进行定量，或者难以明确确认不存在低频率变体。方法，包括多重化方法，其将高检测灵敏度和高准确性结合，可提供对通过之前的方法无法检测到或无法最佳地检测到的某些低频率变体改善的鉴定和/或定量。

技术实现思路

[0007]本文提供了方法，包括多重化方法，其将高检测灵敏度和高准确性结合，提供对无法检测到或无法最佳地检测到或定量的某些低频率变体改善的鉴定和/或定量。
[0008]在某些实施方式中，本文提供了一种用于鉴定核酸群中一种或多种次要核酸物质的存在或不存在的多重化方法，所述核酸群包括所述一种或多种次要核酸物质和一种或多种主要核酸物质的混合物，其中每种次要核酸物质是对应的主要核酸物质的变体，并且其拷贝数小于其对应的主要核酸物质的拷贝数，其中该方法包括：
[0009](a)在包括dNTP的扩增条件下用扩增引物对同时扩增混合物的靶区域，由此产生包含主要和次要核酸物质的核酸的扩增混合物；
[0010](b)在包括链终止剂的延伸条件下使扩增混合物与延伸引物接触，其中：
[0011](i)一种或多种主要核酸物质共有对于主要核酸物质特异且对次要核酸物质非特异的共同链终止剂，和
[0012](ii)一种或多种次要核酸物质中的每一种具有对于次要核酸物质特异并且对于主要核酸物质非特异的链终止剂，其中对于次要核酸物质特异的链终止剂：(A)对于扩增混合物中的特定次要核酸物质是独特的，并且不被扩增混合物中的其他次要核酸物质所共有，或(B)一种或多种次要核酸物质中的至少一种与扩增混合物中的至少一种其他次要核酸物质共有共同的链终止剂，
[0013]由此引物延伸到相对于主要核酸物质的次要核酸物质中不同的核苷酸位置或通过其中，从而产生分别对应于次要核酸物质和主要核酸物质的链终止的延伸产物，其中对于主要核酸物质特异的链终止剂的浓度小于对于一种或多种次要核酸物质特异的每种链终止剂的浓度；和
[0014](c)分析(b)的延伸产物，从而鉴定一种或多种次要核酸物质的存在或不存在。
[0015]在某些实施方式中，核酸群包括多种次要核酸物质，其是单一主要核酸物质的变体，并且在单一多重化反应中鉴定所述多种次要核酸物质。在一些实施方式中，该方法的部分(b)在一组至少两个反应容器或隔室中进行，其中：
[0016]第一容器或隔室包括含有针对主要核酸物质特异的链终止剂并且不含针对一种或多种次要核酸物质特异的链终止剂的延伸条件；和
[0017]每个剩余的容器或隔室包括延伸条件，其包含对一种或多种次要核酸物质特异且共有的单一链终止剂，并且不含对于主要核酸物质特异或针对次要核酸物质特异且不共有共同的单一链终止剂的链终止剂。在一些实施方式中，每种链终止剂的浓度是已知的。
[0018]本文还提供了定量核酸群中一种或多种次要核酸物质的方法，所述核酸群包括所
述一种或多种次要核酸物质和主要核本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种用于鉴定核酸群中一种或多种次要核酸物质的存在或不存在的多重化方法，所述核酸群包括所述一种或多种次要核酸物质和一种或多种主要核酸物质的混合物，其中每种次要核酸物质是对应的主要核酸物质的变体，并且其拷贝数小于其对应的主要核酸物质的拷贝数，其中所述方法包括：(a)在包括dNTP的扩增条件下用扩增引物对同时扩增混合物的靶区域，由此产生包含主要和次要核酸物质的核酸的扩增混合物；(b)在包括链终止剂的延伸条件下使扩增混合物与延伸引物接触，其中：(i)一种或多种主要核酸物质共有对于主要核酸物质特异且对次要核酸物质非特异的共同链终止剂，和(ii)一种或多种次要核酸物质中的每一种具有对于次要核酸物质特异并且对于主要核酸物质非特异的链终止剂，其中对于次要核酸物质特异的链终止剂：(A)对于扩增混合物中的特定次要核酸物质是独特的，并且不被扩增混合物中的其他次要核酸物质所共有，或(B)一种或多种次要核酸物质中的至少一种与扩增混合物中的至少一种其他次要核酸物质共有共同的链终止剂，由此引物延伸到相对于主要核酸物质的次要核酸物质中不同的核苷酸位置或通过其中，从而产生分别对应于次要核酸物质和主要核酸物质的链终止的延伸产物，其中对于主要核酸物质特异的链终止剂的浓度小于对于一种或多种次要核酸物质特异的每种链终止剂的浓度；和(c)分析(b)的延伸产物，从而鉴定一种或多种次要核酸物质的存在或不存在。2.如权利要求1所述的方法，其中核酸群包括多种次要核酸物质，其是单一主要核酸物质的变体，并且在单一多重化反应中鉴定所述多种次要核酸物质。3.如权利要求1所述的方法，其中(b)在一组至少2个反应容器或隔室中进行，其中：第一容器或隔室包括含有针对主要核酸物质特异的链终止剂并且不含针对一种或多种次要核酸物质特异的链终止剂的延伸条件；和每个剩余的容器或隔室包括延伸条件，其包含对一种或多种次要核酸物质特异且共有的单一链终止剂，并且不含对于主要核酸物质特异或针对次要核酸物质特异且不共有共同的单一链终止剂的链终止剂。4.如权利要求1
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3中任一项所述的方法，其中每个链终止剂的浓度是已知的。5.一种定量核酸群中一种或多种次要核酸物质的方法，所述核酸群包括所述一种或多种次要核酸物质和主要核酸物质的混合物，其中所述次要核酸物质是相同的主要核酸物质的变体并且各自以比主要核酸物质的拷贝数低的拷贝数存在，所述方法包括：(a)在包括dNTP的扩增条件下用扩增引物对同时扩增混合物的靶区域，由此产生包含主要和次要核酸物质的核酸的扩增混合物；(b)在延伸条件下使扩增混合物与延伸引物接触，所述延伸条件包括对于(i)一种或多种次要核酸物质中的每一种，和(ii)主要核酸物质特异性链终止剂，由此引物延伸到相对于主要核酸物质的次要核酸物质中不同的核苷酸位置或通过其中，从而产生分别对应于次要核酸物质和主要核酸物质的链终止的延伸产物，其中：(1...

【专利技术属性】
技术研发人员：A，
申请(专利权)人：基纳生物技术有限公司，
类型：发明
国别省市：