一种靶向肝脏的工程化外泌体制备方法技术

本发明专利技术提供了一种靶向肝脏的工程化外泌体，还提供了该工程化外泌体的制备方法，该外泌体采用α

【技术实现步骤摘要】
一种靶向肝脏的工程化外泌体制备方法


[0001]本专利技术涉及生物医学
，具体为一种靶向肝脏的工程化外泌体制备方法。

技术介绍

[0002]外泌体是指包含了复杂RNA和蛋白质的小膜泡(30
‑
150nm)，这些外囊泡可以介导细胞间的通讯，已被用作将各种有效生物活性物质(例如蛋白质、脂质和核酸)输送至受体细胞的传递介质，多种细胞在正常及病理状态下均可分泌外泌体，其主要来源于细胞内溶酶体微粒内陷形成的多囊泡体，经多囊泡体外膜与细胞膜融合后释放到胞外基质中，所有培养的细胞类型均可分泌外泌体，且外泌体天然存在于体液中，包括血液、唾液、尿液、脑脊液和乳汁中，有关他们分泌和摄取及其组成、“运载物”和相应功能的精确分子机制刚刚开始研究，外泌体被视为特异性分泌的膜泡，参与细胞间通讯，对外泌体的研究兴趣日益增长，无论是研究其功能还是了解如何将其用于微创诊断的开发。
[0003]外泌体携带有多种蛋白质、脂类、RNA等重要信息，近年来，随着外泌体研究的不断深入，其应用已经涉及肿瘤治疗、医学基础和免疫治疗等领域，工程化外泌体作为药物递送载体治疗肝脏疾病受制于“器官特异性分布”的影响，这是由外泌体表面上独特的整合素表达特征决定的，富含整合素α
v
β5的外泌体更多地聚集于肝脏，为了制备靶向肝脏的外泌体可以用基因转染的策略，本专利技术提出一种靶向肝脏的工程化外泌体制备方法。

技术实现思路

[0004](一)解决的技术问题
[0005]针对现有技术的不足，本专利技术提供了一种靶向肝脏的工程化外泌体制备方法，采用α
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β5转染肝癌细胞HepG2，得到过表达α
v
β5的肝癌细胞，收集该细胞的上清，超速离心法获得的外泌体，该外泌体为具有肝脏靶向性的外泌体。
[0006](二)技术方案
[0007]为实现上述目的，在本专利技术的一个方面，提供一种靶向肝脏的工程化外泌体，该外泌体采用α
v
β5转染肝癌细胞HepG2得到过表达α
v
β5的肝癌细胞，然后收集细胞上清通过超速离心法获得，制得的工程化外泌体具有肝脏靶向性，可应用在肝脏疾病治疗中。
[0008]而在本专利技术的另一方面，提供了该靶向肝脏的工程化外泌体的制备方法，包括以下步骤：
[0009]1)采用α
v
β5对肝癌细胞HepG2进行转染，制得具有过表达整合素α
v
β5的肝癌细胞HepG2；
[0010]2)收集步骤1)制得的具有过表达整合素α
v
β5的肝癌细胞HepG2的上清，然后通过超速离心的方法获得该工程化外泌体。
[0011]在具体的实施方案中，采用α
v
β5对肝癌细胞HepG2进行转染具体包括以下步骤：
[0012](1)载体构建：基因合成整合素α
v
β5，将其构建到表达载体pcDNA3.1 上；
[0013](2)细胞培养及转染：培养HepG2细胞，待细胞密度达到80％左右，转染上述质粒，
转染8h后换液，48h后收集细胞。
[0014]同时，收集具有过表达整合素αvβ5的肝癌细胞HepG2的上清，然后通过超速离心的方法获得该工程化外泌体具体包括以下步骤：
[0015](1)分别收集对应分组的细胞上清，4℃1000rpm离心10min，去除细胞碎片；
[0016](2)将上清放入新的离心管中，4℃2000g离心10min，进一步去除杂质；
[0017](3)取上清，15ml超滤管(10KD)浓缩，4℃3500g离心20min；
[0018](4)0.22μm滤膜过滤后，超高速离心机120000g离心90min，弃上清，沉淀用PBS重悬。
[0019](三)有益效果
[0020]与现有技术相比，本专利技术提供了一种靶向肝脏的工程化外泌体制备方法，具备以下有益效果：
[0021]本专利技术获得了肝脏靶向性的外泌体，对于肝脏疾病的治疗具有重大意义，其采用α
v
β5转染HepG2细胞，获得过表达α
v
β5的HepG2细胞，收集该细胞的上清用超速离心的方法获得外泌体，也高表达α
v
β5，为了进一步证实该外泌体靶向肝脏，采用PKH26对外泌体进行染色后，注射小鼠，发现荧光聚集于肝脏，这些结果证实了我们得到了靶向肝脏的外泌体，此方法高效便捷，对于疾病的治疗有极大的指导意义。
附图说明
[0022]图1为本专利技术制备工程化外泌体的流程示意图；
[0023]图2为本专利技术qPCR检测α
v
β5表达量的结果示意图；
[0024]图3为本专利技术Western blot检测α
v
β5表达量的结果示意图；
[0025]图4为本专利技术NTA检测外泌体浓度、大小的结果示意图；
[0026]图5为本专利技术TEM检测外泌体形态的结果示意图；
[0027]图6为本专利技术Western blot检测外泌体CD9、TSG101以及整合素α
v
β5的表达结果示意图；
[0028]图7为本专利技术制得的工程化外泌体进行裸鼠试验的结果示意图。
具体实施方式
[0029]本专利技术实施例中所用的试剂如下：
[0030]0.22μm滤膜(津腾)、离心机(湘仪)、超高速离心机(贝克曼)、实时荧光定量PCR仪(ABI)、电泳仪(六一)、Trizol(Life)、ReverTra Ace qPCRRT Kit(东洋纺)、SYBR GREEN Realtime PCR Master Mix(东洋纺)、 CD9\TSG101\α
v
β5\β
‑
actin抗体(Abcam)以及肝癌细胞系HepG2等。
[0031]下面将结合本专利技术的实施例，对本专利技术实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本专利技术一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本专利技术中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本专利技术保护的范围。
[0032]工程化外泌体作为药物递送载体治疗肝脏疾病受制于“器官特异性分布”的影响，这是由外泌体表面上独特的整合素表达特征决定的，富含整合素α
v
β5的外泌体更多地聚集
于肝脏，可以用基因转染的策略制备具有天然的肝脏靶向性的外泌体。
[0033]基于此，在本专利技术的一个方面，提供一种靶向肝脏的工程化外泌体，该外泌体采用α
v
β5转染肝癌细胞HepG2得到过表达α
v
β5的肝癌细胞，然后收集细胞上清通过超速离心法获得，制得的工程化外泌体具有肝脏靶向性，可应用在肝脏疾病治疗中。
[0034]而在本专利技术的另一方面，提供了该靶向肝脏的工程化外泌体的制备方法，包括以下步骤：
[0035]1)本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种靶向肝脏的工程化外泌体，其特征在于，所述外泌体采用α
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β5转染肝癌细胞HepG2得到过表达α
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β5的肝癌细胞，然后收集细胞上清通过超速离心法获得。2.权利要求1所述的靶向肝脏的工程化外泌体在肝脏疾病治疗中的应用。3.一种靶向肝脏的工程化外泌体制备方法，其特征在于，包括以下步骤：1)采用α
v
β5对肝癌细胞HepG2进行转染，制得具有过表达整合素α
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β5的肝癌细胞HepG2；2)收集步骤1)制得的具有过表达整合素α
v
β5的肝癌细胞HepG2的上清，然后通过超速离心的方法获得该工程化外泌体。4.根据权利要求3所述的一种靶向肝脏的工程化外泌体制备方法，其特征在于，步骤1)中所述的采用α
v
β5对肝癌细胞HepG2进行转染具体包括...

【专利技术属性】
技术研发人员：李立，吴笛笛，刘瑾，陈佳佳，高强，刘丕菊，
申请(专利权)人：多莱泌生物科技武汉有限公司，
类型：发明
国别省市：