一种磷酸化TaupT217蛋白单克隆抗体、ELISA试剂盒及其应用制造技术

本发明专利技术公开了一种磷酸化Tau pT217蛋白单克隆抗体、ELISA试剂盒及其应用，本发明专利技术以包含tau蛋白的217位苏氨酸(T217)磷酸化的抗原序列免疫复合物和包含tau蛋白412～434位氨基酸的抗原序列免疫复合物进行动物免疫，制备出磷酸化Tau pT217蛋白的单克隆抗体和tau(412～434)蛋白多克隆抗体，所述磷酸化Tau pT217蛋白的单克隆抗体是由杂交瘤细胞株Tau

【技术实现步骤摘要】
一种磷酸化Tau pT217蛋白单克隆抗体、ELISA试剂盒及其应用


[0001]本专利技术属于生物医药
，具体涉及一种磷酸化Tau pT217蛋白单克隆抗体、ELISA试剂盒及其应用。

技术介绍

[0002]阿尔茨海默病(Alzheimer's disease，AD)是以进行性加重的智能衰退为临床特征的神经变性疾病，是老年痴呆发生的最主要原因。AD致病的主要原因是由于大脑中Tau蛋白过度磷酸化导致神经元缠结(neurofibrillary tangles，NFTs)和大脑中β淀粉样蛋白(β
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amyloid，Aβ)大量沉积构成老年斑，进而导致神经元功能异常。
[0003]Tau蛋白是脑内一种功能蛋白，在成熟正常人脑内含2～3个磷酸化位点，Tau蛋白基因位于17号染色体，由于tau蛋白mRNA的剪辑方式不同可表达出含352～441个氨基酸的6种同构异构体，它是含量最高的微管相关蛋白，大量存在于中枢系统及其周围的神经细胞内，它的作用之一是与微管蛋白相结合以促进其聚合形成微管，另外，还可以加强微管的动力学稳定性，降低微管蛋白的解离，诱导微管成束，而其本身不易被磷酸化。而微管是维持神经细胞骨架完整及神经细胞体和轴突物质转运所必须的结构。相反，AD脑内的tau蛋白(即PHF
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Tau)磷酸化的位点却很多，而且PHF
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Tau不与微小管结合，极易发生磷酸化。异常磷酸化和异常糖基化的tau蛋白是脑内神经元纤维缠结(NFT)中双股螺旋丝(PHF)的主要成分之一，高磷状态下的tau蛋白连接微小管的作用大为降低，且可自动聚集成成对的螺旋丝(PHF)，PHF聚集在AD患者脑受累神经元中形成NFT，成为AD特征性病理改变之一。
[0004]许多研究表明，在阿尔茨海默病及其他tau蛋白引起的病理过程中，tau蛋白的过度磷酸化可能发生在最早期，发生在tau蛋白的181位苏氨酸(T181)磷酸化，是最常见的磷酸化形式之一。文献(Palmqvist S,Janelidze S,Q Uiroz Y,et al.Discriminative Accuracy of Plasma Phospho
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tau217 for Alzheimer Disease vs Other Neurodegenerative Disorders[J].JAMA The Journal of the American Medical Association,2020,324(8).)中发现了发生在tau蛋白的217位苏氨酸(T217)磷酸化是AD患者早期的标志诊断物，因此，如果能快速检测出磷酸化Tau pT217蛋白，就能在早期诊断出阿尔茨海默病，这对于预防和治疗阿尔茨海默病具有重要的意义。目前，市面上只有极少数厂家开发出检测磷酸化Tau pT217蛋白的试剂盒，但存在检测灵敏度不高、特异性不强等问题。
[0005]有鉴于此，有必要开发一种检测人磷酸化Tau pT217蛋白的ELISA试剂盒来解决上述问题。

技术实现思路

[0006]本专利技术的目的在于克服现有技术的不足，提供一种磷酸化Tau pT217蛋白单克隆抗体、ELISA试剂盒及其应用，本专利技术将包含tau蛋白的217位苏氨酸(T217)磷酸化的抗原序
列免疫复合物和包含tau蛋白412～434位氨基酸的抗原序列免疫复合物进行动物免疫，制备出磷酸化Tau pT217蛋白的单克隆抗体和tau(412～434)蛋白多克隆抗体，分别作为捕获抗体和检测抗体用于ELISA双抗夹心试剂盒中，并且建立了磷酸化Tau pT217蛋白的检测试剂盒使用方法及其应用。
[0007]本专利技术的一个目的在于提供一种磷酸化Tau pT217蛋白单克隆抗体。
[0008]一种磷酸化Tau pT217蛋白单克隆抗体，所述磷酸化Tau pT217蛋白单克隆抗体重链氨基酸序列如SEQ ID NO：3所示，所述磷酸化Tau pT217蛋白单克隆抗体轻链氨基酸序列如SEQ ID NO：4所示。
[0009]进一步地，所述磷酸化Tau pT217蛋白单克隆抗体是由杂交瘤细胞株Tau
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6G12分泌得到，所述杂交瘤细胞株Tau
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6G12已在中国典型培养物保藏中心(CCTCC)进行保藏；地址：中国武汉武汉大学；保藏日期：2021年12月30日；保藏编号为：CCTCC NO：C2021304。
[0010]进一步地，编码所述磷酸化Tau pT217蛋白单克隆抗体重链核苷酸序列如SEQ ID NO：1所示；编码所述磷酸化Tau pT217蛋白单克隆抗体轻链核苷酸序列如SEQ ID NO：2所示。
[0011]本专利技术的另一个目的在于提供一种ELISA试剂盒。
[0012]一种ELISA试剂盒，所述ELISA试剂盒包括上述任一项所述的磷酸化Tau pT217蛋白单克隆抗体、tau(412～434)蛋白多克隆抗体、酶标板、封闭液、HRP
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羊抗鼠IgG二抗、显色液、终止液、包被液和洗涤液。
[0013]进一步地，所述磷酸化Tau pT217蛋白单克隆抗体作为捕获抗体，所述tau(412～434)蛋白多克隆抗体作为检测抗体。
[0014]进一步地，所述磷酸化Tau pT217蛋白单克隆抗体稀释度为(1:600)～(1:4800)；所述tau(412～434)蛋白多克隆抗体稀释度为(1:600)～(1:9600)。
[0015]进一步地，所述HRP
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羊抗鼠IgG二抗稀释度为(1:3200)～(1:12800)。
[0016]本专利技术还提供了上述任一项所述的ELISA试剂盒的使用方法，包括如下步骤：
[0017]1)纯化单抗包被：用包被液将磷酸化Tau pT217蛋白单克隆抗体稀释，4℃过夜，每孔100μL，4℃冰箱过夜；
[0018]2)封闭：每孔加200μL封闭液，于37℃孵育0.5～1.5h；
[0019]3)加抗原：每孔加100μL样品，于37℃孵育1～2h；
[0020]4)加纯化多抗：用封闭液将tau(412～434)蛋白多克隆抗体稀释，37℃孵育1～2h，每孔100μL；
[0021]5)加酶标二抗：用封闭液将HRP
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羊抗鼠IgG二抗稀释，37℃孵育1～2h，每孔100μL；
[0022]6)底物显色：每孔加显色液100μL，显色10min；
[0023]7)终止反应：每孔加2mol/L浓硫酸50μL/孔，测定OD
450nm
反应值；
[0024]在第1)～5)每步之间用洗涤液洗板3～5次，每次6～10min。
[0025]进一步地，所述封闭液选自5％脱脂乳粉、2.5％脱脂乳粉、0.5％脱脂乳粉、3％BSA、1％BSA和0.5％BSA中的一种。
[0026]本专利技术最后提供了上述任一项所述的ELISA试剂盒在制备检本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种磷酸化Tau pT217蛋白单克隆抗体，其特征在于，所述磷酸化Tau pT217蛋白单克隆抗体重链氨基酸序列如SEQ ID NO：3所示，所述磷酸化Tau pT217蛋白单克隆抗体轻链氨基酸序列如SEQ ID NO：4所示。2.如权利要求1所述的磷酸化Tau pT217蛋白单克隆抗体，其特征在于，所述磷酸化Tau pT217蛋白单克隆抗体是由杂交瘤细胞株Tau
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6G12分泌得到，所述杂交瘤细胞株Tau
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6G12已在中国典型培养物保藏中心(CCTCC)进行保藏；地址：中国武汉武汉大学；保藏日期：2021年12月30日；保藏编号为：CCTCC NO：C2021304。3.如权利要求1所述的磷酸化Tau pT217蛋白单克隆抗体，其特征在于，编码所述磷酸化Tau pT217蛋白单克隆抗体重链核苷酸序列如SEQ ID NO：1所示；编码所述磷酸化Tau pT217蛋白单克隆抗体轻链核苷酸序列如SEQ ID NO：2所示。4.一种ELISA试剂盒，其特征在于，所述ELISA试剂盒包括权利要求1～3任一项所述的磷酸化Tau pT217蛋白单克隆抗体、tau(412～434)蛋白多克隆抗体、酶标板、封闭液、HRP
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羊抗鼠IgG二抗、显色液、终止液、包被液和洗涤液。5.如权利要求4所述的ELISA试剂盒，其特征在于，所述磷酸化Tau pT217蛋白单克隆抗体作为捕获抗体，所述tau(412～434)蛋白多克隆抗体作为检测抗体。6.如权利要求4所述的ELISA试剂盒，其特...

【专利技术属性】
技术研发人员：王小川，王喆，曾宽，吴刚，
申请(专利权)人：武汉天德生物科技有限公司，
类型：发明
国别省市：