用于牛体外胚胎生产的高效玻璃化冷冻方法技术

本发明专利技术提供一种用于牛体外胚胎生产的高效玻璃化冷冻方法。本发明专利技术首次将β

【技术实现步骤摘要】
用于牛体外胚胎生产的高效玻璃化冷冻方法


[0001]本专利技术涉及牛体外胚胎生产
，具体地说，涉及一种用于牛体外胚胎生产的高效玻璃化冷冻方法。

技术介绍

[0002]牛体外胚胎生产具有重要的经济意义和社会价值，它可以用为克隆、核移植、转基因动物生产等提供胚胎来源，快速扩繁优良家畜群体，作为种质资源保存的手段保护濒危动物，具有重要的理论意义和社会意义。然而，牛体外胚胎生产冷冻后移植妊娠率(35.89+3.87％)显著低于新鲜体外胚胎生产(51.35+1.87％)，这极大地限制了它们的应用(Niu et al.,2014)。据IETS统计数据显示，1997
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2017年期间全球牛体外胚胎移植以鲜胚移植为主，冻胚移植比例仅为20％，与此同时，全球体内胚胎移植中冻胚移植比例超过60％(Ferr
é
et al.,2020)。可见，牛体外胚胎生产冷冻技术已经成为制约牛体外胚胎产业化应用的关键瓶颈，亟需建立高效的用于牛体外胚胎生产的冷冻技术。

技术实现思路

[0003]本专利技术的目的是提供一种用于牛体外胚胎生产的高效玻璃化冷冻方法。
[0004]为了实现本专利技术目的，一方面，本专利技术提供β
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烟酰胺单核苷酸在牛体外胚胎生产中提高牛IVF胚胎玻璃化冷冻效率中的应用。
[0005]研究表明，胚胎脂滴含量与其冷冻后发育能力呈负相关。通过对降低胚胎脂滴含量是否可促进其发育能力和改善冷冻效果进行研究。结果表明，通过离心去脂法和化学去脂法均可有效降低脂滴含量，并提高胚胎的发育能力与冷冻效果。离心去脂法主要通过CB处理增强细胞骨架稳定性，随后离心使脂滴极化，再利用显微打孔技术将脂滴吸出离心降脂法需要专业的显微操作设备、技术难度较大，且打孔会影响卵母细胞或胚胎的后续发育能力。因此，该方法的应用逐渐减少。相较于离心去脂法，添加降脂物质降脂法细胞毒性小、不存在机械损伤且去脂效果好。因此，添加降脂物质已成为当前胚胎去脂的主要方法。β
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烟酰胺单核苷酸(Nicotinamide mononucleotide，NMN)又称为烟酰胺单核苷酸，是合成辅酶I
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烟酰胺腺嘌呤二核苷酸(nicotinamide adenine dinucleotide，NAD+)的关键前体之一，广泛存在于各类生物细胞，参与众多代谢活动。在动物繁殖生理中，NMN可通过恢复线粒体功能、减少活性氧、维持正常的纺锤体与染色体结构提高衰老卵母细胞的减数分裂和受精能力，降低胚胎致死率。在促进脂代谢方面，NMN也具有巨大的应用潜能。Wang LF(2017)等报道烟酰胺磷酸核糖转移酶(Nicotinamide phosphoribosyltransferase，NAMPT)可通过激活Sirt1信号通路抑制FASN和ACC等成脂基因的表达进而减少脂质沉积；NMN作为NAMPT的酶产物，也可有效抑制FK866(NAMPT抑制剂)诱导的肝脏细胞脂质沉积。与之相似，Uddin GM(2020)发现NMN可通过下调脂肪合成(脂肪酸合酶Fasn；乙酰辅酶a羧化酶1Acc1)、转运(脂肪酸转运蛋白CD36)相关基因的表达，上调脂肪分解代谢相关基因(肉碱脂酰转移酶1Cpt1)的表达抑制肝脏脂肪沉积。这些研究表明NMN有可能作为潜在的卵母细胞及胚胎去
脂物质用以提高其耐冻性，促进牛体外冷冻胚胎的生产。
[0006]另一方面，本专利技术提供一种用于牛体外胚胎生产的高效玻璃化冷冻方法，包括以下步骤：
[0007]1)牛卵母细胞体外成熟；
[0008]2)牛体外受精胚胎的生产；
[0009]3)牛体外胚胎的冷冻。
[0010]其中，步骤1)将牛卵母细胞置于含有β
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烟酰胺单核苷酸的体外成熟液中进行培养，且步骤2)将体外受精后的牛卵母细胞置于含有β
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烟酰胺单核苷酸的牛体外受精胚胎培养液中进行培养，然后步骤3)将牛体外胚胎进行玻璃化冷冻。
[0011]进一步地，体外成熟液、体外受精胚胎培养液中β
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烟酰胺单核苷酸的浓度分别为0.1
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100μM，优选10μM。
[0012]进一步地，体外成熟液、体外受精胚胎培养液中还添加有生长因子和缝隙链接蛋白。
[0013]所述生长因子为胰岛素生长因子(如IGF1)和/或表皮生长因子，所述缝隙链接蛋白为CX37。
[0014]其中，胰岛素生长因子1(IGF1)是胰岛素生长因子家族中的重要成员，其可通过自分泌、内分泌和旁分泌的三种途径产生低分子多肽，IGF1调节细胞的增殖与胚胎发育(Adashi et al.,1985)。IGF1在卵母细胞功能中非常重要，由于它们的受体存在于卵丘
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卵母细胞复合体(COCs)中，并且卵丘细胞特别产生大量这种因子，在牦牛COCs可测得IGF1及其受体IGFIR表达(Pan et al.,2015)。
[0015]表皮生长因子(EGF)是EGF配体家族成员，它的主要功能是促进卵母细胞成熟和卵丘细胞扩张。在体内，它能够协调LH信号通路，最终将LH从体细胞中传递进入卵母细胞中，进而促进卵母细胞成熟。缝隙链接蛋白37(Connexin37，Cx37)是一种链接蛋白，是组成卵母细胞与卵丘细胞之间缝隙链接(gap junction)的组成蛋白。而缝隙链接能够加强卵丘细胞和卵母细胞之间的物质、信息交流，进而加速卵母细胞的成熟进程。
[0016]上述三种物质对牛卵母细胞IVM效率及其IVF胚胎抗冻性的影响机制，目前还缺乏研究。
[0017]优选地，体外成熟液中胰岛素生长因子的浓度为200ng/mL，表皮生长因子的浓度为100ng/mL，CX37的浓度为25μg/mL。
[0018]体外受精胚胎培养液中胰岛素生长因子的浓度为200ng/mL，表皮生长因子的浓度为100ng/mL，CX37的浓度为25μg/mL。
[0019]进一步地，步骤3)将牛体外胚胎置于含有0.1％
‑
1％纳米颗粒的玻璃化冷冻液中进行冷冻。
[0020]在本专利技术的一个具体实施方式中，用于牛体外胚胎生产的高效玻璃化冷冻方法，包括以下步骤：
[0021](1)牛卵母细胞体外成熟
[0022]在牛卵巢上采集直径2
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8mm卵泡中卵丘
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卵母细胞复合体COCs，选择含有3层及以上颗粒细胞COCs用体外成熟液洗涤3
‑
4遍后，按30
‑
50枚COCs/每孔/500μL体外成熟液放入预平衡(2h)的四孔板培养液中，于38.5℃、5％CO2及饱和湿度二氧化碳培养箱中培养；其
中，所述体外成熟液为TCM199+10μg/mL FSH+10μg/mL LH+10μg/mL E2+10％FBS，且体外成熟液中添加有0.1
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100μM的β
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烟酰胺单核苷酸；
[0023]本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.β
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烟酰胺单核苷酸在牛体外胚胎生产中提高牛IVF胚胎玻璃化冷冻效率中的应用。2.用于牛体外胚胎生产的高效玻璃化冷冻方法，其特征在于，包括以下步骤：1)牛卵母细胞体外成熟；2)牛体外受精胚胎的生产；3)牛体外胚胎的冷冻；其中，步骤1)将牛卵母细胞置于含有β
‑
烟酰胺单核苷酸的体外成熟液中进行培养，且步骤2)将体外受精后的牛卵母细胞置于含有β
‑
烟酰胺单核苷酸的牛体外受精胚胎培养液中进行培养，然后步骤3)将牛体外胚胎进行玻璃化冷冻。3.根据权利要求2所述的方法，其特征在于，体外成熟液、体外受精胚胎培养液中β
‑
烟酰胺单核苷酸的浓度分别为0.1
‑
100μM，优选10μM。4.根据权利要求2所述的方法，其特征在于，体外成熟液、体外受精胚胎培养液中还添加有生长因子和缝隙链接蛋白。5.根据权利要求4所述的方法，其特征在于，所述生长因子为胰岛素生长因子和/或表皮生长因子，所述缝隙链接蛋白为CX37。6.根据权利要求5所述的方法，其特征在于，体外成熟液中胰岛素生长因子的浓度为200ng/mL，表皮生长因子的浓度为100ng/mL，CX37的浓度为25μg/mL；体外受精胚胎培养液中胰岛素生长因子的浓度为200ng/mL，表皮生长因子的浓度为100ng/mL，CX37的浓度为25μg/mL。7.根据权利要求2
‑
6任一项所述的方法，其特征在于，步骤3)将牛体外胚胎置于含有0.1％
‑
1％纳米颗粒的玻璃化冷冻液中进行冷冻。8.根据权利要求2所述的方法，其特征在于，包括以下步骤：(1)牛卵母细胞体外成熟在牛卵巢上采集直径2
‑
8mm卵泡中卵丘
‑
卵母细胞复合体COCs，选择含有3层及以上颗粒细胞COCs用体外成熟液洗涤3
‑
4遍后，按30
‑
50枚COCs/每孔/500μL体外成熟液放入预平衡的四孔板培养液中，于38.5℃、5％CO2及饱和湿度二氧化碳培养箱中培养；其中，所述体外成熟液为TCM199+10μg/mL FSH+10μg/mL LH+10μg/mL E2+10％FBS...

【专利技术属性】
技术研发人员：赵学明，徐茜，
申请(专利权)人：中国农业科学院北京畜牧兽医研究所，
类型：发明
国别省市：