结合生物基质胶生成hiPSC-RPE细胞膜片的方法技术

本发明专利技术涉及一种结合生物基质胶生成hiPSC

【技术实现步骤摘要】
结合生物基质胶生成hiPSC
‑
RPE细胞膜片的方法


[0001]本专利技术涉及hiPSC
‑
RPE细胞膜片领域，尤其涉及一种结合生物基质胶生成 hiPSC
‑
RPE细胞膜片的方法。

技术介绍

[0002]在室温条件下，基质胶Matrigel聚合形成具有生物学活性的三维基质，模 拟体内细胞基底膜的结构、组成、物理特性和功能，有利于体外细胞的培养和分 化，可用于对细胞形态、生化功能、迁移、侵染和基因表达等的研究。目前基质 胶均从富含胞外基质蛋白的EHS小鼠肿瘤中提取出基底膜基质，其主要成分有层 粘连蛋白、Ⅳ型胶原、巢蛋白、硫酸肝素糖蛋白，还包含生长因子和基质金属蛋 白酶等。
[0003]现有RPE sheets的制备主要依据合成材料，其与天然的BM膜的环境有很多 差异，尚无用hiPSC来源RPE证明在Uvea
‑
Gel上的安全性和有效性。因此，设 计一种水凝胶代替目前临床中使用的羊膜，更真实的模拟BM微环境，借助hiPSCs 向3D视网膜分化体系，开发成GMP级别的hiPSC
‑
RPE片，促进临床转化和应用 是现阶段工作重点。

技术实现思路

[0004]为此，本专利技术提供一种结合生物基质胶生成hiPSC
‑
RPE细胞膜片的方法，优 化出从猪脉络膜组织分离制备脱细胞基质水凝胶，结合建立的hiPSC诱导3D视 网膜分化系统，获得hiPSC
‑
RPE细胞，建立模拟Bruch膜(BM)微环境的生成 RPE片的方法，为培养GMP级别干细胞提供安全有效的生物材料。
[0005]为实现上述目的，本专利技术提供一种结合生物基质胶生成hiPSC
‑
RPE细胞膜片 的方法，包括：
[0006]步骤S1，将预处理后的猪眼葡萄膜制备脱细胞基质胶；
[0007]步骤S2，维持培养hiPSCs；
[0008]步骤S3，培养hiPSC
‑
RPE悬浮球；
[0009]步骤S4，hiPSC
‑
RPE细胞扩增培养；
[0010]步骤S5,生成hiPSC
‑
RPE细胞膜片；
[0011]其中，所述步骤S5中，将浓度为1％的Uvea
‑
Gel包被培养皿，于37℃放置 30min左右，待Uvea
‑
Gel凝固，形成一层薄薄的膜样区域为BM膜，用以模拟天 然BM微环境。
[0012]进一步地，所述步骤S1中，预处理后的猪眼葡萄膜经两轮浸泡后冷冻干燥 形成脱细胞基质粉末，脱细胞基质粉末用胃蛋白酶酶解后，与0.1N氢氧化钠溶 液中和形成脱细胞基质胶。
[0013]进一步地，第一轮浸泡依次采用5％Triton X
‑
100浸泡4h，5％SDS浸泡4h， 4M尿素浸泡4h，用去离子水浸泡1.5h，第二轮浸泡依次采用1％Triton X
‑
100 浸泡3h，PBS洗15min，1％Triton X
‑
100浸泡18h。
[0014]进一步地，在所述步骤S2中，将hiPSCs接种于脱细胞基质胶包被的培养板， 于
mTeSR1(Stem Cell)培养基中维持培养4
‑
5天，选取克隆密度长至约80％
‑
90％ 底面积时进行传代。
[0015]进一步地，在所述步骤S3中，将维持培养后的hiPSCs采用0.5mM的EDTA 消化为小细胞团，向小细胞团内加入含有10μM的Blebbistatin的培养液，并 将其转移至低吸附皿中，于37℃培养过夜，24h后可见EBs形成，将形成的EBs 连续保持悬浮培养6天后诱导分化，其中，EBs培养第一天培养液替换为25％NIM 和75％mTeSR1，EBs培养第二天培养液替换为50％NIM和50％mTeSR1，EBs培养 第三天，将EBs转移到到含有NIM培养液培养3天，EBs培养第6
‑
7天，将EBs 重新接种在用脱细胞基质胶包被的培养皿中，开始贴壁培养诱导分化，诱导分化 25天，富集形成RPE球。
[0016]进一步地，所述诱导分化后形成的3D视网膜诱导分化的视杯样结构为典型 六边形结构，且色素化。
[0017]进一步地，在所述步骤S4中，将富集的RPE球悬浮培养8周后分成若干小 块，将小块RPE球于37℃条件下，用dispase II孵育5
‑
10min，解离成单细胞 悬液，将单细胞悬液接种在0.1％的Uvea
‑
Gel包被的培养板中进行扩增。
[0018]进一步地，所述单细胞悬液扩增初期选用血清培养基，后期选用无血清培养 基促进hiPSC
‑
RPE分化成熟。
[0019]进一步地，在所述步骤S5Z中，单细胞hiPSC
‑
RPE接种至BM膜上，进行增 殖和分化，hiPSC
‑
RPE细胞生长4
‑
6周后可形成含色素并且紧密连接的RPE片。
[0020]进一步地，将形成的Uvea
‑
Gel/hiPSC
‑
RPE细胞膜片分割为任意大小，通过 dispase II孵育3
‑
5min后，将hiPSC
‑
RPE细胞膜片脱离基质胶层，形成hiPSC
‑
RPE 细胞膜片。
[0021]与现有技术相比，本专利技术的有益效果在于，本专利技术制备葡萄膜组织脱细胞基 质来源的水凝胶(Uvea
‑
Gel)，水凝胶的组成成分包含类似于BM细胞外基质的 多肽，可以更真实地模拟BM微环境，代替目前研究或临床中使用的羊膜，人工 合成材料或单一或几种成分合成的水凝胶。为培养GMP级别干细胞提供安全有效 的生物材料。
[0022]尤其，本专利技术首次将可以模拟天然BM微环境的Uvea
‑
Gel和hiPSC
‑
RPE细胞 结合起来，一方面验证了hiPSC
‑
RPE细胞在这种微环境中的良好生物相容性，可 以快速增长和分化成熟，为未来应用患者个性化hiPSC移植治疗细胞的培养和维 护奠定基础；另一方面在模拟天然BM微环境中生成hiPSC
‑
RPE细胞膜片，更接 近体内RPE，预计转化成GMP级别的hiPSC
‑
RPE细胞膜片，能更好地应用于临床， 并发挥有效地作用。
[0023]尤其，本专利技术借助hiPSCs向3D视网膜分化体系，获得hiPSC
‑
RPE，将细胞 接种在Uvea
‑
Gel上进行增殖和分化，获得在模拟天然BM环境中生成的 hiPSC
‑
RPE片，鉴于无肿瘤体系来源成分(例如Matrigel)，该体系产物更易开 发成GMP级别的hiPSC
‑...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种结合生物基质胶生成hiPSC
‑
RPE细胞膜片的方法，其特征在于，包括：步骤S1，将预处理后的猪眼葡萄膜制备脱细胞基质胶；步骤S2，维持培养hiPSCs；步骤S3，培养hiPSC
‑
RPE悬浮球；步骤S4，hiPSC
‑
RPE细胞扩增培养；步骤S5,生成hiPSC
‑
RPE细胞膜片；其中，所述步骤S5中，将浓度为1％的Uvea
‑
Gel包被培养皿，于37℃放置30min左右，待Uvea
‑
Gel凝固，形成一层薄薄的膜样区域为BM膜，用以模拟天然BM微环境。2.根据权利要求1所述的结合生物基质胶生成hiPSC
‑
RPE细胞膜片的方法，其特征在于，所述步骤S1中，预处理后的猪眼葡萄膜经两轮浸泡后冷冻干燥形成脱细胞基质粉末，脱细胞基质粉末用胃蛋白酶酶解后，与0.1N氢氧化钠溶液中和形成脱细胞基质胶。3.根据权利要求2所述的结合生物基质胶生成hiPSC
‑
RPE细胞膜片的方法，其特征在于，第一轮浸泡依次采用5％Triton X
‑
100浸泡4h，5％SDS浸泡4h，4M尿素浸泡4h，用去离子水浸泡1.5h，第二轮浸泡依次采用1％Triton X
‑
100浸泡3h，PBS洗15min，1％Triton X
‑
100浸泡18h。4.根据权利要求3所述的结合生物基质胶生成hiPSC
‑
RPE细胞膜片的方法，其特征在于，在所述步骤S2中，将hiPSCs接种于脱细胞基质胶包被的培养板，于mTeSR1(Stem Cell)培养基中维持培养4
‑
5天，选取克隆密度长至约80％
‑
90％底面积时进行传代。5.根据权利要求1所述的结合生物基质胶生成hiPSC
‑
RPE细胞膜片的方法，其特征在于，在所述步骤S3中，将维持培养后的hiPSCs采用0.5mM的EDTA消化为小细胞团，向小细胞团内加入含有10μM的Blebbistatin的培养液，并将其转移至低吸附皿中，于37℃培养过夜，24h后可见EBs形成，将形成的EB...

【专利技术属性】
技术研发人员：李桂兰，刘奕志，郑颖丰，
申请(专利权)人：中山大学中山眼科中心，
类型：发明
国别省市：