一种特异性识别甲氧苄啶的核酸适配体及其筛选和应用制造技术

本发明专利技术属于生物技术领域，具体涉及一种特异性识别甲氧苄啶的核酸适配体及其筛选和应用，所述核酸适配体的核苷酸序列为SEQ ID NO.1所示序列。本发明专利技术填补了关于甲氧苄啶特异性适配体序列的空白；相比于目前现有的其他检测甲氧苄啶的技术，SELEX技术筛选出的核酸适配体TMP

【技术实现步骤摘要】
一种特异性识别甲氧苄啶的核酸适配体及其筛选和应用


[0001]本专利技术属于生物
，具体涉及一种特异性识别甲氧苄啶的核酸适配体及其筛选和应用。

技术介绍

[0002]在动物饲养过程中，为预防疾病、促进动物生长等常使用抗生素。随着抗生素在动物饲养过程中的广泛使用，不可避免地造成动物源性食品中抗生素的残留问题。动物源性食品中的抗生素残留是全球普遍关注的问题，尤其是在中国这个世界上最大的抗生素生产国和消费国更应引起重视。抗生素在动物体内及其产品中残留，经食物链进入人体，对人体健康造成潜在的危害。人体内长期积累的抗生素残留物除了对肝和肾造成损害外，还会导致过敏反应以及肠道菌群失衡等问题。
[0003]甲氧苄啶(trimethoprim，TMP)是一种人工合成的二氨基嘧啶类药物，属于二氢叶酸还原酶抑制剂。其作用机制为通过抑制二氢叶酸还原酶活性，阻止细菌菌体中的二氢叶酸还原成四氢叶酸，进而影响菌体合成核酸，蛋白等，使细菌生长和繁殖不能正常进行。在兽临床上常作为抗菌增效剂最常与磺胺类药物联合使用，达到抗菌增效的效果。由于甲氧苄啶的大量广泛使用和不合理用药，导致了动物性食品中的药物残留。TMP的理化性质稳定，可通过食物链在人体内富集，对人体健康造成危害。因此，各国和欧盟等都对TMP在动物组织中的最高残留限量做出了规定，如TMP的标志残留物是其本身，在牛、猪、鱼、禽的靶组织中的最大残留限量值(MRL)为50μg/kg，在马的靶组织中的最大残留限量值为100μg/kg。针对不断出现的动物源性食品中的抗生素残留问题，建立检测动物性食品中甲氧苄啶的残留方法，对保证人们的健康和饮食安全具有重要意义。
[0004]甲氧苄啶检测现有检测技术主要有两类，免疫法和仪器法。免疫法主要包括酶联免疫吸附测定法和胶体金免疫试纸条等；仪器法主要包括高效液相色谱法、液相色谱质谱联用法、伏安法、毛细管电泳法等，其中以高效液相色谱法、液相色谱质谱联用法最为常见。这些方法的使用过程中会遇到一系列困难，如严苛的保存条件；大型昂贵的设备不便携、耗时；高样品量和复杂的样品前处理；需要训练有素的技术人员操作；电极易受腐蚀等常见问题。相比之下，基于适配体的检测方法有以下几个优点：易保存、操作简单、检测设备成本低、小型化。此外，基于适配体的传感器显示出高选择性和灵敏度。可以有效地检测和量化被检测物质。
[0005]适配体是一种以指数富集配体系统进化(SELEX)技术筛选得到高亲和力特异性结合靶标的单链寡核苷酸分子(ssDNA或RNA)。寡核苷酸适配体具有一些显著的特点：靶分子范围广、高亲和力和高特异性、筛选周期短。适配体的靶分子包括蛋白、多肽、氨基酸、有机染料、毒素、金属离子等，可以是大分子的蛋白质，也可以是一些小分子的毒素；可以在氢键、范德华力等作用下与相应的靶分子嵌合形成稳定的复合物，这种空间构象的稳定契合使得适配体与靶物质结合的解离常数可达nmol甚至pmol水平；整个筛选过程约1
‑
2个月时间，无需动物实验。如今适配体在医学诊断、环境监测、食品安全均有应用。目前适配体在兽
药残留检测中已有一定的应用，但尚未有关于甲氧苄啶特异性适配体筛选研究的报道。
[0006]SELEX技术是适配体筛选过程的核心。近年来SELEX技术不断创新发展，开发出许多新型SELEX技术，例如毛细管电泳
‑
SELEX、细胞
‑
SELEX、加尾
‑
SELEX、Capture
‑
SELEX等。其中，Capture
‑
SELEX是一种适用于小分子靶标的基于文库固定，靶标游离的筛选新方法。初始文库是核酸适配体筛选的源头，作为SELEX技术的根本，其设计是否合理直接影响到筛选的成败和效率。核酸适配体的结构越复杂，其与靶标结合的亲和力越高。而目前研究发现，核酸适配体筛选所用的初始文库大多数结构简单，其中含有的多是简单的线性茎环结构以及低分支结构，而高阶结节结构以及多分支结构含量较少。

技术实现思路

[0007]本专利技术旨在提供一种特异性识别甲氧苄啶的核酸适配体及其筛选和应用，通过设计一种五段式的结构复杂的初始文库，筛选得到特异性识别甲氧苄啶的核酸适配体，在某些方面优于现有的色谱法和免疫法，易保存、成本低、不需要依赖大型仪器设备和专业技术人员，并且具有较好的亲和力和特异性。
[0008]本专利技术的第一方面提供了一种特异性识别甲氧苄啶的核酸适配体(TMP
‑
1)，所述核酸适配体的核苷酸序列为SEQ ID NO.1所示序列。
[0009]进一步的，所述核酸适配体的一级结构为：
[0010]5′‑
AATCAAACGCTAAGGTCGGAGGGAGGTGCACCCATTCTTGGACGCAGCCCGGCGAGCGGCAGAGTGCAGAAAGCTTGGTACCCGTATCGT
‑3′
；二级结构具有突出的茎和环；吉布斯自由能ΔG＝
‑
8.56kcal/mol。
[0011]进一步的，所述核酸适配体的3
′
端或5
′
端经修饰物修饰。
[0012]进一步的，所述修饰物为电化学标记物、酶标记物、荧光基团或生物素。
[0013]本专利技术的第二方面提供了上述特异性识别甲氧苄啶的核酸适配体的筛选方法，包括以下步骤，
[0014]S1：构建初始文库，所述初始文库的序列如下述通式所示，5
′‑
AATCAAACGCTAAGG
‑
N10
‑
GTGCACCCATTCTTG
‑
N30
‑
AAGCTTGGTACCCGTATCGT
‑3′
，其中，N表示碱基A、T、C或G，N10表示随机片段长度为10个碱基，N30表示随机片段长度为30个碱基；
[0015]S2：将所述初始文库与靶标结合，去除非特异性结合的序列，得到次级文库；所述靶标包括正筛靶标和反筛靶标，所述正筛靶标为甲氧苄啶，所述反筛靶标为磺胺甲恶唑；
[0016]S3：对所述次级文库进行测序，选择结构稳定且自由能较低的序列；再筛选出对甲氧苄啶具有高亲和力和高特异性的序列，得到所述特异性识别甲氧苄啶的核酸适配体。
[0017]核酸适配体一级序列的碱基组成，与其二、三级结构的复杂程度对其与靶标的结合能力有较大的影响。因此，通过增加筛选文库的一级序列丰度与结构多样性以及复杂性，可以提高筛选出高亲和力核酸适配体的可能性。本专利技术设计了一级序列丰度更高的五段式文库，总长90nt，包含了两段用于PCR扩增的引物序列，中间15nt的固定序列，以及引物序列和固定序列中间的随机序列，筛选初始文库的随机序列有40个碱基，根据公式文库容量＝4
N
，计算得理论初始文库容量约为10
24
。
[0018]进一步的，所述步骤S2的具体操作如下：将所述初始文库与捕获探针杂交形成本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种特异性识别甲氧苄啶的核酸适配体，其特征在于，所述核酸适配体的核苷酸序列为SEQ ID NO.1所示序列。2.如权利要求1所述的特异性识别甲氧苄啶的核酸适配体，其特征在于，所述核酸适配体的3
′
端或5
′
端经修饰物修饰。3.如权利要求2所述的特异性识别甲氧苄啶的核酸适配体，其特征在于，所述修饰物为电化学标记物、酶标记物、荧光基团或生物素。4.如权利要求1所述的特异性识别甲氧苄啶的核酸适配体的筛选方法，其特征在于，包括以下步骤，S1：构建初始文库，所述初始文库的序列如下述通式所示，5
′‑
AATCAAACGCTAAGG
‑
N10
‑
GTGCACCCATTCTTG
‑
N30
‑
AAGCTTGGTACCCGTATCGT
‑3′
，其中，N表示碱基A、T、C或G，N10表示随机片段长度为10个碱基，N30表示随机片段长度为30个碱基；S2：将所述初始文库与靶标结合，去除非特异性结合的序列，得...

【专利技术属性】
技术研发人员：段诺，李昌鑫，吴世嘉，宋铭倩，王周平，
申请(专利权)人：江南大学，
类型：发明
国别省市：