一种全人源抗PD-1的单克隆抗体No.1-10及其应用制造技术

本发明专利技术提供一种全人源抗PD

【技术实现步骤摘要】
一种全人源抗PD
‑
1的单克隆抗体No.1
‑
10及其应用


[0001]本专利技术抗体工程
，具体涉及一种全人源抗PD
‑
1的单克隆抗体No.1
‑
10及其应用。

技术介绍

[0002]程序性细胞死亡受体1(PD
‑
1)是由pdcd1基因编码的一种I型跨膜糖蛋白，具有288个氨基酸的蛋白质。结构分为胞外区免疫球蛋白可变区样结构域、跨膜区以及胞内区。其中，PD
‑
1的胞内结构域，包括两个重要的酪氨酸基序，分别是免疫受体酪氨酸基抑制基序(ITIM)和免疫受体酪氨酸基转换基序(ITSM)。PD
‑
1属于CD28超家族中的一员，主要表达在活化的T细胞表面，以及NK细胞，B细胞，肿瘤相关巨噬细胞等。1992年，Tasuku Honjo教授首先在小鼠体内分离和鉴定了PD
‑
1基因，并认为PD
‑
1分子的活化会导致T细胞的凋亡。但直至1999年，科研人员通过对PD
‑
1缺失的小鼠的研究观察到小鼠的自身免疫疾病发生的现象，才逐步阐明了PD
‑
1的免疫抑制功能。PD
‑
1的配体有PD
‑
L1(又称B7
‑
H1或CD274)和PD
‑
L2(又称B7
‑
DC或CD273)。PD
‑
L1可表达于不同类型的细胞上，包括免疫细胞，上皮细胞，内皮细胞，尤其是肿瘤细胞。PD
‑
L2仅表达于抗原提呈细胞(APCs)。促炎症细胞因子，如I型和II型干扰素、肿瘤坏死因子α(TNF
‑
α)和血管内皮生长因子(VEGF)的表达可诱导细胞PD
‑
L1和PD
‑
L2的表达。在机体的免疫应答过程中，T细胞的激活，除了需要第一信号，即T细胞受体识别APCs上的组织相容复合体(MHC)提呈的抗原肽，还需要共刺激信号，即共刺激受体CD28结合APCs的B7受体。但若共抑制受体PD
‑
1结合配体PD
‑
L1或PD
‑
L2，则抑制T细胞的增殖。因此，使用PD
‑
1/PD
‑
L1抗体，可以阻断免疫检查点PD
‑
1/PD
‑
L1信号，恢复T细胞的增殖和杀伤能力，从而达到杀伤肿瘤细胞的目的。
[0003]距离1986年FDA批准的第一款单克隆抗体药物，至今已有超过100款抗体药物获批上市。目前，抗体工程技术的出现加速了人源抗体的制备和筛选，通过基因工程技术制备的重组抗体主要包括人鼠嵌合抗体、人源化抗体、全人源化抗体等等。噬菌体展示技术具备筛选周期短、体外高亲和力成熟、无需抗原免疫等优点，成为全人源抗体制备的主要技术平台。
[0004]噬菌体展示技术是将外源编码多肽或蛋白质的基因通过基因工程技术插入到噬菌体外壳蛋白结构基因的适当位置，使其能与噬菌体的衣壳蛋白形成融合蛋白，随子代噬菌体的重新组装呈现在噬菌体表面，可以保持相对的空间结构和生物活性。将抗体片段与噬菌体衣壳蛋白融合表达展示于噬菌体表面，可以得到噬菌体展示抗体库，主要有以下三种类型：scFv库(由VH和VL组成，并由一个小肽(Gly4Ser)3连接成一个单链多肽)、Fab库(含有VH
‑
CH和VL
‑
CL，并由二硫键连接在一起)和VHH库(只有重链可变区)。噬菌体抗体库的筛选模拟了抗体亲和力成熟的过程。利用靶抗原，采用合适的淘洗方法，洗去未特异性结合的噬菌体。再用酸或者竞争的分子洗脱下结合的噬菌体，中和后的噬菌体感染大肠杆菌扩增，经过3
‑
5轮的富集，逐步提高可以特异性识别靶抗原的噬菌体比例，最终获得识别靶抗原的高亲和力噬菌体抗体。
[0005]文献报道DNA链上富含GC位点可以通过反式作用因子(Cys2His2)调控转录过程。由于真核染色质的开放性对基因表达有至关重要的作用，而目的基因附近的GC
‑
rich结构可以通过赋予DNA双链更好的刚性，进而促进染色质的开放。pMH3表达载体则是基于“GC rich”机制的哺乳动物表达载体，含有3个约1000bp长度的，来自鸡βactin基因的富含GC的DNA片段，因此pMH3表达载体具有超高外源蛋白表达能力。此外，pMH3表达载体既含有便于在原核中扩增复制的原核DNA序列(如复制子、抗生素抗性基因、单一的限制性酶切位点等)，也有只能在哺乳动物细胞中应用的表达原件(包括启动子、增强子、5
’
非编码序列、3
’
非编码序列、S/MARs元件、内含子、PolyA尾等)，适用于哺乳动物细胞系统的高表达稳定细胞株的构建。
[0006]中国仓鼠卵巢细胞(CHO)能不断增殖，能稳定整合外源基因并保持高效的外源蛋白表达水平；作为哺乳动物细胞，可以准确的进行外源基因转录后修饰的功能，使表达的蛋白在功能、结构上接近于天然蛋白分子；可通过悬浮培养的方式在无血清培养环境中进行高密度培养，大规模生产重组蛋白。因此，CHO哺乳动物细胞表达系统是目前基因工程类药物研发和生产最重要的表达系统之一。

技术实现思路

[0007]本专利技术的目的之一是提供一种全人源抗PD
‑
1的单克隆抗体No.1
‑
10，是通过基因重组获得的新型全人源抗PD
‑
1全长抗体No.1
‑
10，包含重链可变区和轻链可变区，以及抗体恒定区，所述重链可变区VH的多核苷酸序列如SEQ ID No.1所示，所述重链可变区VH的氨基酸序列如SEQ ID No.2所示，所述轻链可变区VL的多核苷酸序列如SEQ ID No.3所示，所述轻链可变区VL的氨基酸序列如SEQ ID No.4所示。
[0008]所述全长抗体No.1
‑
10的重链可变区和轻链可变区，包含完整的互补决定区CDR1、CDR2和CDR3；所述的重链可变区VH CDR1的氨基酸序列为:HNINTF，重链可变区VH CDR 2的氨基酸序列为：AAS，重链可变区VH CDR3的氨基酸序列为：QQANSFPRT；所述的轻链可变区VL CDR1的氨基酸序列为：GYRFGSYY，轻链可变区VL CDR2的氨基酸序列为：INPTGGYT；轻链可变区VL CDR3的氨基酸序列为：ARDLGGSGYSHFDY。
[0009]本专利技术的另一个目的是提供一种重组抗体表达载体，包含所述的重链可变区的多核苷酸序列SEQ ID No.1或轻链可变区的多核苷酸序列SEQ ID No.3。
[0010]本专利技术还提供一种转染上述重组抗体表达载体的宿主细胞，所述宿主细胞包含原核细胞E.coil DH5α以及哺乳动物细胞CHO
‑
K1。
[0011]本专利技术所述单克隆抗体No.本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种全人源抗PD
‑
1的单克隆抗体No.1
‑
10，其特征在于，包含重链可变区和轻链可变区，以及抗体恒定区，所述重链可变区VH的多核苷酸序列如SEQ ID No.1所示，所述重链可变区VH的氨基酸序列如SEQ ID No.2所示，所述轻链可变区VL的多核苷酸序列如SEQ ID No.3所示，所述轻链可变区VL的氨基酸序列如SEQ ID No.4所示。2.权利要求1所述的一种全人源抗PD
‑
1的单克隆抗体No.1
‑
10，其特征在于，所述抗体No.1
‑
10包含完整的互补决定区CDR1、CDR2和CDR3；所述的重链可变区VH CDR1的...

【专利技术属性】
技术研发人员：梁可莹，詹金彪，梅圣圣，彭珊珊，陈洁，高向征，
申请(专利权)人：浙江大学，
类型：发明
国别省市：