用于在发酵中生产、回收和分泌疏水化合物的改进方法技术

本发明专利技术涉及用于在涉及微生物诸如酵母的培育的发酵工艺中生产疏水化合物，特别是作为信息素诸如昆虫信息素的疏水化合物的改进方法，所述微生物产生所述疏水化合物，其中所述方法促进来自发酵肉汤的所述疏水化合物的回收，增加所述疏水化合物的滴度并且/或者增加来自所述微生物的所述疏水化合物的分泌。来自所述微生物的所述疏水化合物的分泌。来自所述微生物的所述疏水化合物的分泌。

【技术实现步骤摘要】
【国外来华专利技术】用于在发酵中生产、回收和分泌疏水化合物的改进方法


[0001]本专利技术涉及用于在涉及微生物诸如酵母的培育的发酵工艺中生产疏水化合物，特别是作为信息素(诸如昆虫信息素)的疏水化合物的改进方法，所述微生物产生所述疏水化合物，其中所述方法促进来自发酵肉汤的所述疏水化合物的回收，增加所述疏水化合物的滴度并且/或者增加来自所述微生物的所述疏水化合物的分泌。

技术介绍

[0002]活细胞，特别是微生物细胞，如今被广泛用于许多化合物的生物生产。此类化合物的实例是脂肪醇、脂肪酰基乙酸酯和脂肪醛，诸如昆虫信息素，它们可以在例如酵母细胞中产生。此类化合物在农业中有应用，并且可以例如被用作绿色害虫驱虫剂。可由细胞(例如经基因工程改造的细胞)产生的其他有用的化合物是萜烯和类萜。萜烯是由植物天然产生的，并且在食品、制药、化妆品和生物技术等领域有许多工业应用。例如，它们被用作天然农业杀虫剂的一部分。类萜(也称为类异戊二烯)是含有额外基团(通常是含O基团)的改性萜烯。它们通常因其芳香特性而被使用并被用作传统草药方剂的一部分。虽然萜烯和类萜广泛存在，但它们从天然来源中的提取通常是有问题的。因此，它们通常是通过化学合成来生产，通常由石化产品生产。
[0003]上述化合物的共同特性是它们是疏水的或亲脂的。它们从发酵肉汤中的回收通常涉及多种有机溶剂，这引入了许多挑战，包括工艺安全性、对多个提取步骤的需求、对从终产物中去除溶剂残留物的需求，以及大量的劳动力和成本(金钱成本和环境成本二者)。
[0004]涉及重组微生物的发酵工艺带来的另一个挑战是感兴趣的化合物可能大部分保留在细胞内。因此，一种或多种产物从细胞中有限分泌到发酵肉汤中可能限制感兴趣的化合物的回收，或者最好的情况下也需要涉及细胞裂解以使化合物释放到肉汤中的额外步骤。使产物从细胞中分泌到发酵肉汤中存在多种优势，诸如降低产物抑制和降解、减少对宿主细胞的影响、更高的滴度，以及更容易且更便宜的回收工艺(Borodina I.,2019)。当所分泌的亲脂性产物可以在单独的相中回收时，则实现了特定的工艺优势。
[0005]因此，对用于回收疏水性发酵产物的改进方法，以及对用于在发酵工艺中增加来自细胞的疏水化合物的分泌的改进方法存在需求。

技术实现思路

[0006]本专利技术的方法解决了上述挑战。
[0007]本文提供了一种用于在发酵中生产疏水化合物诸如脂肪醇、脂肪醇酯、脂肪酰基乙酸酯、脂肪醛和/或萜烯诸如类萜的方法，所述方法包括提供能够产生所述疏水化合物的微生物以及在允许产生所述疏水化合物的条件下在培养基中培养所述微生物的步骤，其中培养基包含提取剂，该提取剂的量等于或大于它在水溶液中被测得的混浊浓度，其中提取剂是非离子表面活性剂，诸如消泡剂，优选选自以下的聚乙氧基化表面活性剂：聚乙二醇聚丙二醇(polyethylene polypropylene glycol)、聚醚分散体的混合物、包含聚乙二醇单硬
脂酸酯的消泡剂、西甲硅油以及基于乙氧基化和丙氧基化C
16
‑
C
18
醇的剂或者基于乙氧基化和丙氧基化C
16
‑
C
18
醇的消泡剂以及其组合，所述方法任选地进一步包括回收疏水化合物的步骤。因此，本文提供了一种用于在发酵中生产选自脂肪醇、脂肪醇酯、脂肪酰基乙酸酯、脂肪醛和萜烯的疏水化合物的方法，所述方法包括提供能够产生所述疏水化合物的酵母细胞以及在允许产生所述疏水化合物的条件下在培养基中培养所述酵母细胞的步骤，其中培养步骤是在培育温度下执行，其中培养基包含提取剂，其量等于或大于其在培育温度下在水溶液(诸如培养基)中被测得的混浊浓度，其中提取剂是非离子乙氧基化表面活性剂，该方法进一步包括回收疏水化合物的步骤。
[0008]本文还提供了一种用于在发酵中增加疏水化合物诸如脂肪醇、脂肪醇酯、脂肪酰基乙酸酯、脂肪醛和/或萜烯诸如类萜的滴度的方法，所述方法包括在允许产生所述疏水化合物的条件下在培养基中培养能够产生所述疏水化合物的微生物，其中培养基包含提取剂，其量等于或大于其在水溶液中的混浊浓度，其中提取剂是非离子表面活性剂，诸如消泡剂，优选选自以下的聚乙氧基化表面活性剂：聚乙二醇聚丙二醇、聚醚分散体的混合物、包含聚乙二醇单硬脂酸酯的消泡剂、西甲硅油以及基于乙氧基化和丙氧基化C
16
‑
C
18
醇的剂或基于乙氧基化和丙氧基化C
16
‑
C
18
醇的消泡剂以及其组合，由此使疏水化合物的滴度与在相似条件下在不存在提取剂的情况下或在提取剂以低于其在水溶液中的混浊浓度的量存在的情况下执行的发酵相比增加。本文还提供了一种用于在发酵中增加选自脂肪醇、脂肪醇酯、脂肪酰基乙酸酯、脂肪醛和萜烯的疏水化合物的滴度的方法，所述方法包括在允许产生所述疏水化合物的条件下在培养基中培养能够产生所述疏水化合物的酵母细胞，其中培养步骤是在培育温度下执行，其中培养基包含提取剂，其量等于或大于其在培育温度下在水溶液中被测得的混浊浓度，其中提取剂是非离子乙氧基化表面活性剂，由此使疏水化合物的滴度与在相同条件下但在不存在提取剂的情况下或在提取剂以低于其在相同培育温度下在水溶液中的混浊浓度的量存在的情况下执行的发酵相比增加。
[0009]本文还提供了一种用于在发酵中增加来自能够产生所述疏水化合物的微生物的疏水化合物诸如脂肪醇、脂肪醇酯、脂肪酰基乙酸酯、脂肪醛和/或萜烯(诸如类萜)的分泌的方法，所述方法包括在允许产生所述疏水化合物的条件下在培养基中培养所述微生物，其中培养基包含提取剂，其量等于或大于其在水溶液中被测得的混浊浓度，其中提取剂是非离子表面活性剂，诸如消泡剂，优选选自以下的聚乙氧基化表面活性剂：聚乙二醇聚丙二醇、聚醚分散体的混合物、包含聚乙二醇单硬脂酸酯的消泡剂、西甲硅油以及基于乙氧基化和丙氧基化C
16
‑
C
18
醇的剂或基于乙氧基化和丙氧基化C
16
‑
C
18
醇的消泡剂以及其组合，由此使来自微生物的疏水化合物的分泌与在相似条件下在不存在提取剂的情况下或在提取剂以低于它在水溶液中被测得的混浊浓度的量存在的情况下执行的发酵相比增加。本文还提供了一种用于在发酵中增加来自能够产生所述疏水化合物的酵母细胞的选自脂肪醇、脂肪醇酯、脂肪酰基乙酸酯、脂肪醛和/或萜烯的疏水化合物的分泌的方法，所述方法包括在允许产生所述疏水化合物的条件下在培养基中培养所述酵母细胞，其中培养步骤是在培育温度下执行，其中培养基包含提取剂，其量等于或大于其在培育温度下在水溶液中被测得的混浊浓度，其中提取剂是非离子乙氧基化表面活性剂，由此使来自酵母细胞的疏水化合物的分泌与在相同条件下但在不存在提取剂的情况下或在提取剂以低于它在培育温度下在水溶液中被测得的混浊浓度的量存在的情况下执行的发酵相比增加。
[0010]本文还提供了可通过本文公开的方法获得的疏水化合物，优选其中疏水化合物选自脂肪醇、脂肪醇酯、本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
【国外来华专利技术】1.一种用于在发酵中生产选自脂肪醇、脂肪醇酯、脂肪酰基乙酸酯、脂肪醛和萜烯的疏水化合物的方法，所述方法包括提供能够产生所述疏水化合物的酵母细胞以及在允许产生所述疏水化合物的条件下在培养基中培养所述酵母细胞的步骤，其中所述培养步骤是在培育温度下执行，其中所述培养基包含提取剂，其量等于或大于其在培育温度下在水溶液诸如培养基中被测得的混浊浓度，其中所述提取剂是非离子乙氧基化表面活性剂，所述方法进一步包括回收所述疏水化合物的步骤。2.一种用于在发酵中增加选自脂肪醇、脂肪醇酯、脂肪酰基乙酸酯、脂肪醛和萜烯的疏水化合物的滴度的方法，所述方法包括在允许产生所述疏水化合物的条件下在培养基中培养能够产生所述疏水化合物的酵母细胞，其中所述培养步骤是在培育温度下执行，其中所述培养基包含提取剂，其量等于或大于其在培育温度下在水溶液中被测得的混浊浓度，其中所述提取剂是非离子乙氧基化表面活性剂，由此使所述疏水化合物的滴度与在相同条件下但在不存在提取剂的情况下或在提取剂以低于它在培育温度下在水溶液中被测得的混浊浓度的量存在的情况下执行的发酵相比增加。3.一种用于在发酵中增加来自能够产生所述疏水化合物的酵母细胞的选自脂肪醇、脂肪醇酯、脂肪酰基乙酸酯、脂肪醛和萜烯的疏水化合物的分泌的方法，所述方法包括在允许产生所述疏水化合物的条件下在培养基中培养所述酵母细胞，其中所述培养步骤是在培育温度下执行，其中所述培养基包含提取剂，其量等于或大于其在培育温度下在水溶液中被测得的混浊浓度，其中所述提取剂是非离子乙氧基化表面活性剂，由此使来自所述酵母细胞的所述疏水化合物的分泌与在相同条件下但在不存在提取剂的情况下或在提取剂以低于它在培育温度下在水溶液中被测得的混浊浓度的量存在的情况下执行的发酵相比增加。4.根据前述权利要求中任一项所述的方法，其中所述非离子乙氧基化表面活性剂是脂肪醇烷氧基化物或聚乙氧基化表面活性剂。5.根据前述权利要求中任一项所述的方法，其中所述非离子乙氧基化表面活性剂选自：Agnique BP420(CAS号68002
‑
96
‑
0)、聚乙二醇聚丙二醇、聚醚分散体的混合物、包含聚乙二醇单硬脂酸酯的消泡剂、西甲硅油、基于乙氧基化和丙氧基化C
16
‑
C
18
醇的剂以及基于乙氧基化和丙氧基化C
16
‑
C
18
醇的消泡剂以及其组合。6.根据前述权利要求中任一项所述的方法，其中所述脂肪醇是饱和脂肪醇、去饱和脂肪醇，或者其混合物，并且/或者其中所述脂肪酰基乙酸酯是饱和脂肪酰基乙酸酯、去饱和脂肪酰基乙酸酯，或者其混合物。7.根据前述权利要求中任一项所述的方法，其中所述脂肪醛是饱和脂肪醛、去饱和脂肪醛，或者其混合物。8.根据前述权利要求中任一项所述的方法，其中所述脂肪醇、脂肪酰基乙酸酯和/或脂
肪醛具有8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21或22的碳链长度。9.根据前述权利要求中任一项所述的方法，其中所述萜烯是倍半萜，诸如红没药烯。10.根据前述权利要求中任一项所述的方法，其中所述脂肪醇酯是脂肪醇乙酸酯。11.根据前述权利要求中任一项所述的方法，其中所述非离子乙氧基化表面活性剂选自C
16
‑
C
18
烷基醇乙氧基化物丙氧基化物(CAS号68002
‑
96
‑
0)、Agnique BP420(CAS号68002
‑
96
‑
0)、聚乙二醇聚丙二醇、消泡剂204、包含聚乙二醇单硬脂酸酯的表面活性剂，以及脂肪醇烷氧基化物。12.根据前述权利要求中任一项所述的方法，其中所述聚乙二醇聚丙二醇是P407(CAS号9003
‑
11
‑
6)。13.根据前述权利要求中任一项所述的方法，其中所述非离子乙氧基化表面活性剂是Agnique BP420(CAS号68002
‑
96
‑
0)。14.根据前述权利要求中任一项所述的方法，其中所述表面活性剂是西甲硅油。15.根据前述权利要求中任一项所述的方法，其中所述脂肪醇烷氧基化物选自LF300(CAS号196823
‑
11
‑
7)、LF1300(68002
‑
96
‑
0)、SLF180(CAS号196823
‑
11
‑
7)、2574(CAS号68154
‑
97
‑
2)和Imbentin SG/251(CAS号68002
‑
96
‑
0)，优选LF300或2574。16.根据前述权利要求中任一项所述的方法，其中所述培养基包含至少1体积％的非离子乙氧基化表面活性剂，诸如至少1.5体积％，诸如至少2体积％，诸如至少2.5体积％，诸如至少3体积％，诸如至少3.5体积％，诸如至少4体积％，诸如至少5体积％，诸如至少6体积％，诸如至少7体积％，诸如至少8体积％，诸如至少9体积％，诸如至少10体积％，诸如至少12.5体积％，诸如至少15体积％，诸如至少17.5体积％，诸如至少20体积％，诸如至少22.5体积％，诸如至少25体积％，诸如至少27.5体积％，诸如至少30体积％的非离子乙氧基化表面活性剂，或更高体积％的非离子乙氧基化表面活性剂。17.根据前述权利要求中任一项所述的方法，其中所述培养基包含这样的量的所述提取剂，所述量比所述提取剂的混浊浓度大至少50％，诸如至少100％，诸如至少150％，诸如至少200％，诸如至少250％，诸如至少300％，诸如至少350％，诸如至少400％，诸如至少500％，诸如至少750％，诸如至少1000％，或更高。18.根据前述权利要求中任一项所述的方法，其中所述培养基包含这样的量的所述提取剂，所述量是所述提取剂的混浊浓度的至少2倍，诸如所述提取剂的混浊浓度的至少3倍，诸如所述提取剂的混浊浓度的至少4倍，诸如所述提取剂的混浊浓度的至少5倍，诸如所述提取剂的混浊浓度的至少6倍，诸如所述提取剂的混浊浓度的至少7倍，诸如所述提取剂的混浊浓度的至少8倍，诸如所述提取剂的混浊浓度的至少9倍，诸如所述提取剂的混浊浓度的至少10倍，诸如所述提取剂的混浊浓度的至少12.5倍，诸如所述提取剂的混浊浓度的至少15倍，诸如所述提取剂的混浊浓度的至少17.5倍，诸如所述提取剂的混浊浓度的至少20倍，诸如所述提取剂的混浊浓度的至少25倍，诸如所述提取剂的混浊浓度的至少30倍。19.根据前述权利要求中任一项所述的方法，其中由微生物产生的所述疏水化合物存在于发酵肉汤中的乳液中，所述方法进一步包括破坏所述乳液，从而获得包含含有所述提取剂和所述疏水化合物的产物相的组合物的步骤。
20.根据权利要求19所述的方法，其中所述破坏乳液的步骤包括发酵肉汤的相分离步骤诸如离心步骤或者由发酵肉汤的相分离步骤诸如离心步骤组成，从而获得由以下三个相组成的组合物：水相、包含细胞和细胞碎片的相，以及包含所述提取剂和所述疏水化合物的产物相。21.根据权利要求19或20中任一项所述的方法，其中所述产物相包含至少50％，诸如至少55％，诸如至少60％，诸如至少65％，诸如至少70％，诸如至少75％，诸如至少80％，诸如至少85％，诸如至少90％，诸如至少95％或更高初始存在于所述发酵肉汤中的所述疏水化合物。22.根据权利要求19至21中任一项所述的方法，其进一步包括从所述组合物中回收包含所述提取剂和所述疏水化合物的产物相。23.根据权利要求22所述的方法，其进一步包括从所述提取剂中分离出所述疏水化合物，其中所述分离优选为蒸馏，诸如在降低的压力下蒸馏，或者柱纯化。24.根据前述权利要求中任一项所述的方法，其中所述疏水化合物是一种或多种脂肪醇，并且其中所述方法进一步包括优选通过蒸馏步骤诸如在降低的压力下蒸馏或通过柱纯化来回收所述一种或多种脂肪醇，从而获得脂肪醇的混合物的步骤。25.根据权利要求24所述的方法，其进一步包括将所述脂肪醇混合物的脂肪醇中的至少一部分化学转化成相应的脂肪酰基乙酸酯的步骤。26.根据权利要求25所述的方法，其中所述脂肪醇的至少一部分通过乙酰化被转化成相应的脂肪酰基乙酸酯。27.根据权利要求19至26中任一项所述的方法，其进一步包括将所述脂肪醇混合物中的脂肪醇的至少一部分化学转化成相应的脂肪醛的步骤。28.根据权利要求27所述的方法，其中所述脂肪醇的至少一部分通过氧化被转化成相应的脂肪醛。29.根据权利要求25至28中任一项所述的方法，其进一步包括回收所述相应的脂肪酰基乙酸酯和/或所述相应的脂肪醛的步骤。30.根据前述权利要求中任一项所述的方法，其中所述提取剂是从所述发酵肉汤中回收的，并且任选地被再循环到所述发酵肉汤中。31.根据前述权利要求中任一项所述的方法，其中所述疏水化合物的滴度与在相同条件下但在不存在提取剂的情况下或在提取剂以低于它在培育温度下在水溶液诸如培养基中被测得的混浊浓度的量存在的情况下执行的发酵中获得的滴度相比增加了至少5％，诸如增加了至少10％，诸如增加了至少15％，诸如增加了至少20％，诸如增加了至少25％，诸如增加了至少30％，诸如增加了至少35％，诸如增加了至少40％，诸如增加了至少45％，诸如增加了至少46％，诸如增加了至少47％，诸如增加了至少48％，诸如增加了至少49％，诸如增加了至少50％，诸如增加了至少51％，诸如增加了至少52％，诸如增加了至少53％，诸如增加了至少54％，诸如增加了至少55％或增加了更多。32.根据前述权利要求中任一项所述的方法，其中所述疏水化合物的分泌与在相同条件下但在不存在提取剂的情况下或在提取剂以低于它在培育温度下在水溶液诸如培养基中被测得的混浊浓度的量存在的情况下执行的发酵相比增加了至少5％，诸如增加了至少7.5％，诸如增加了至少10％，诸如增加了至少12.5％，诸如增加了至少15％，诸如增加了至
少20％，诸如增加了至少25％，诸如增加了至少30％，诸如增加了至少35％，诸如增加了至少36％，诸如增加了至少37％，诸如增加了至少38％，诸如增加了至少39％，诸如增加了至少40％，诸如增加了至少或增加了更多。33.根据前述权利要求中任一项所述的方法，其中所述酵母属于以下属：酵母属、毕赤酵母属、耶氏酵母属、克鲁维酵母属、假丝酵母属、红酵母属、红冬孢酵母属、隐球菌属、毛孢子菌属或油脂酵母属；优选所述属是酵母属或耶氏酵母属。34.根据前述权利要求中任一项所述的方法，其中所述酵母属于选自酿酒酵母、巴斯德毕赤酵母、马克斯克鲁维酵母、白色隐球菌、产油油脂酵母、斯达氏油脂酵母、圆红冬孢酵母、粘红酵母、普鲁兰毛孢子菌或解脂耶氏酵母的物种，优选所述酵母细胞是酿酒酵母细胞或解脂耶氏酵母细胞。35.根据前述权利要求中任一项所述的方法，其中所述疏水化合物是去饱和脂肪醇。36.根据权利要求35所述的方法，其中所述去饱和脂肪醇是(Z)
‑
11
‑
十六碳烯
‑1‑
醇、(Z)9
‑
十六碳烯
‑1‑
醇、(Z)11
‑
十四碳烯
‑1‑
醇、(E)11
‑
十四碳烯
‑1‑
醇、(Z)9
‑
十四碳烯
‑1‑
醇或E8,E10
‑
十二碳二烯
‑1‑
醇。37.根据前述权利要求中任一项所述的方法，其中所述疏水化合物是饱和或去饱和脂肪醇的乙酸酯，优选其中所述乙酸酯是去饱和脂肪醇的乙酸酯，诸如(Z)9
‑
十四碳烯
‑1‑
基乙酸酯或E8,E10
‑
十二碳二烯乙酸酯。38.根据前述权利要求中任一项所述的方法，其中所述疏水化合物是脂肪醛，优选不饱和脂肪醛，诸如(Z)11
‑
十六碳烯
‑1‑
醛或E8,E10
‑
十二碳二烯醛。39.根据前述权利要求中任一项所述的方法，其中所述酵母细胞能够产生具有至少0.2mg/L的滴度的所述疏水化合物。40.根据前述权利要求中任一项所述的方法，其中所述酵母细胞表达：
‑
选自由以下组成的组的Δ11
‑
去饱和酶：脐橙螟蛾Δ11
‑
去饱和酶(Atr_Δ11；SEQ ID NO:1)、海贪夜蛾Δ11
‑
去饱和酶(Sl_Δ11；SEQ ID NO:2)、黄地老虎Δ11
‑
去饱和酶(As_Δ11；SEQ ID NO:3)、来自葡萄花翅小卷蛾的去饱和酶(Lbo_PPTQ；SEQ ID NO:43)、来自格瑞姆肖果蝇的去饱和酶(Dgd9；SEQ ID NO:44)、来自黑果蝇的去饱和酶(Dvd9；SEQ ID NO:45)以及粉纹夜蛾Δ11
‑
去饱和酶(Tni_Δ11；SEQ ID NO:4)，或者它们的与Atr_Δ11(SEQ ID NO:1)、Sl_Δ11(SEQ ID NO:2)、As_Δ11(SEQ ID NO:3)、Lbop_PPTQ(SEQ ID NO:43)、Dgd9(SEQ ID NO:44)、Dvd9(SEQ ID NO:45)或Tni_Δ11(SEQ ID NO:4)具有至少65％同源性的功能变体，以及
‑
选自由以下组成的组的醇形成脂肪酰基
‑
CoA还原酶(FAR)：Har_FAR(SEQ ID NO:5)、Hs_FAR(SEQ ID NO:6)以及Has_FAR(SEQ ID NO:7)，或者它们的与Har_FAR(SEQ ID NO:5)、Hs_FAR(SEQ ID NO:6)或Has_FAR(SEQ ID NO:7)具有至少80％同源性的功能变体；由此
‑
所述Δ11
‑
去饱和酶能够将所述十六烷酰基
‑
CoA的至少一部分转化成(Z)11
‑
十六碳烯酰基
‑
CoA；以及
‑
所述FAR能够将所述(Z)11
‑
十六碳烯酰基
‑
CoA的至少一部分转化成(Z)
‑
11
‑
十六碳烯醇。41.根据权利要求40所述的方法，其中所述酵母细胞进一步表达脂肪酰基合成酶。
42.根据权利要求41所述的方法，其中所述脂肪酰基合成酶选自由Sc_FAA1(SEQ ID NO:8)、Yl_FAA(SEQ ID NO:9)以及它们的与Sc_FAA1(SEQ ID NO:8)或Yl_FAA(S...

【专利技术属性】
技术研发人员：贝蒂娜，
申请(专利权)人：佰欧菲洛公司，
类型：发明
国别省市：