新颖抗虫基因和使用方法技术

提供了用于赋予细菌、植物、植物细胞、组织和种子杀有害生物活性的组合物和方法。提供了包含毒素多肽的编码序列的组合物。该等编码序列可用于DNA构建体或表达盒中，以用于在植物和细菌中进行转化和表达。组合物还包含转化的细菌、植物、植物细胞、组织和种子。特别地，提供了分离的毒素核酸分子。另外，涵盖与多核苷酸对应的氨基酸序列，以及与那些氨基酸序列特异性结合的抗体。特别地，本发明专利技术提供了分离的核酸分子，该等分离的核酸分子包含编码SEQ ID NO:19至SEQ ID NO:36中任一者所示的氨基酸序列的核苷酸序列，或者SEQ ID NO:1至SEQ ID NO:18中任一者所示的核苷酸序列，以及其变体和片段。和片段。和片段。

【技术实现步骤摘要】
【国外来华专利技术】新颖抗虫基因和使用方法


[0001]本专利技术涉及分子生物学领域。提供了编码杀有害生物蛋白的新颖基因。这些蛋白质和编码它们的核酸序列可用于制备杀有害生物制剂和产生转基因抗害虫植物。

技术介绍

[0002]植物害虫是世界重要农作物损失的主要因素。由于包括昆虫在内的非哺乳动物害虫的侵扰，仅在美国每年就损失约80亿美元。昆虫害虫主要通过密集施用化学杀有害生物剂来防治，所述化学杀有害生物剂通过抑制昆虫生长、阻止昆虫取食或繁殖或致死而有活性。因此可以实现良好的昆虫控制，但这些化学物质有时也可影响其它有益昆虫。化学杀有害生物剂的广泛使用导致的另一个问题是抗性昆虫品种的出现。这已经通过各种抗性管理实践得到了部分缓解，但是对替代害虫防治剂的需求日益增加。生物害虫防治剂，例如表达杀有害生物毒素如δ
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内毒素的苏云金芽孢杆菌(Bacillus thuringiensis)菌株，也已施加至农作物，具有令人满意的结果，从而为化学杀有害生物剂提供了替代或补充。特别地，杀昆虫毒素(例如苏云金芽孢杆菌δ
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内毒素)在转基因植物中的表达提供了针对选定的昆虫害虫的有效保护，并且表达此类毒素的转基因植物已经被商业化，从而允许农民减少化学昆虫防治剂的施加，
[0003]苏云金芽孢杆菌是一种革兰氏阳性芽孢形成土壤细菌，其特征是其能够产生结晶内含物，所述结晶内含物对某些昆虫目和昆虫物种特别有毒，但对植物和其它非靶向生物无害。为此原因，包括苏云金芽孢杆菌菌株或其杀昆虫蛋白的组合物可用作环境可接受的杀昆虫剂以防治农业昆虫害虫或多种人类或动物疾病的昆虫媒介。
[0004]来自苏云金芽孢杆菌的晶体(Cry)蛋白(δ
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内毒素)对主要是鳞翅目、半翅目、双翅目和鞘翅目幼虫具有有效的杀昆虫活性。这些蛋白质还显示出针对膜翅目、同翅目、虱毛目、食毛目和蜱螨目害虫目以及其它无脊椎动物目(例如线形动物门、扁虫动物门和肉鞭毛虫门)的活性(Feitelson(1993)The Bacillus Thuringiensis family tree.在Advanced Engineered Pesticides,Marcel Dekker,Inc.,New York,N.Y.中)。这些蛋白质最初主要基于它们的杀昆虫活性被分类为CryI至CryV。主要类别是鳞翅目特异性(I)、鳞翅目和双翅目特异性(II)、鞘翅目特异性(III)、双翅目特异性(IV)、以及线虫特异性(V)和(VI)。蛋白质被进一步分为亚科；每个家族中更高度相关的蛋白质被分配了门字母，例如Cry1A、Cry1B、Cry1C等。每个门内更密切相关的蛋白质被赋予名称，例如Cry1C1、Cry1C2等。
[0005]基于氨基酸序列同源性而非昆虫靶标特异性描述了Cry基因的命名法(Crickmore等人，(1998)Microbiol.Mol.Biol.Rev.62:807
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813)。在这种分类中，每种毒素都被分配了唯一的名称，包括一级等级(阿拉伯数字)、二级等级(大写字母)、三级等级(小写字母)和四级等级(另一个阿拉伯数字)。罗马数字已被替换为一级等级中的阿拉伯数字。序列同一性低于45％的蛋白质具有不同的一级等级，并且二级等级和三级等级的标准分别为78％和95％。
[0006]晶体蛋白在被摄入并溶解在昆虫中肠中之前不会表现出杀昆虫活性。摄入的原毒
素在昆虫消化道中被蛋白酶水解成活性有毒分子。(和Whiteley(1989)Microbiol.Rev.53:242
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255)。这种毒素与靶标幼虫的中肠中的顶端刷状缘受体结合，并插入顶端膜中，从而创建离子通道或孔隙，导致幼虫死亡。
[0007]δ
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内毒素通常具有五个保守序列结构域和三个保守结构域(参见例如de Maagd等人，(2001)Trends Genetics 17:193
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199)。第一保守结构域由七个α螺旋组成，并参与膜插入和孔隙形成。结构域II由以希腊钥匙配置布置的三个β片层组成，并且结构域III由“胶冻卷”形式的两个反向平行β片层组成(de Maagd等人，2001，出处同上)。结构域II和III参与受体识别和结合，并且因此被认为是毒素特异性的决定因素。
[0008]除了δ
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内毒素，还有其它几种已知的杀有害生物蛋白毒素类别。VIP1/VIP2毒素(参见例如，美国专利5,770,696)是二元杀有害生物毒素，其通过被认为涉及受体介导的内吞作用之后是细胞毒化的机制而对昆虫表现出强活性，该机制类似于其它二元(“A/B”)毒素的作用模式。A/B毒素(例如VIP、C2、CDT、CST)或炭疽杆菌水肿和致死毒素最初通过受体介导的对作为单体的“B”组分的特异性结合来与靶细胞相互作用。然后这些单体形成同七聚体。然后，“B”七聚体
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受体复合物充当对接平台，该对接平台随后结合并允许将酶促“A”组分通过受体介导的内吞作用转运到胞质溶胶中。一旦在细胞的胞质溶胶内，“A”组分就会通过例如G
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肌动蛋白的ADP
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核糖基化或增加环状AMP(cAMP)的细胞内水平来抑制正常细胞功能。参见Barth等人，(2004)Microbiol Mol Biol Rev 68:373
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402。
[0009]密集使用基于苏云金芽孢杆菌的杀昆虫剂已经在小菜蛾(Plutella xylostella)的田间种群中产生了抗药性(Ferre和Van Rie(2002)Annu.Rev.Entomol.47:501
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533)。最常见的抗性机制是减少毒素与其特异性中肠受体的结合。这也可能向其它共享同一受体的毒素赋予交叉耐药性(Ferre和Van Rie(2002))。
[0010]另一个挑战是，事实上在一些情况下，对杀有害生物蛋白结构域的修饰可允许改善对一种害虫的防治，但与此同时会减弱或降低对先前由未修饰的蛋白质防治的另一种害虫的抗性。因此，至关重要的是不仅要考虑源自基因修饰的新杀有害生物活性，还要确保蛋白质维持对所述蛋白质在基因修饰之前对其有活性的其它害虫的抗性。
[0011]由于昆虫可造成的破坏，以及通过防治多种昆虫害虫导致的产量提高，因此不断需要探索新形式的杀有害生物毒素。

技术实现思路

[0012]提供了用于赋予细菌、植物、植物细胞、组织和种子杀有害生物活性的组合物和方法。组合物包含编码杀害虫和杀昆虫多肽的序列的核酸分子、包含这些核酸分子的载体，以及包含所述载体的宿主细胞。组合物还包含杀有害生物多肽序列和针对这些多肽的抗体。所述核苷酸序列可用于DNA构建体或表达盒中，以用于生物体，包括微生物和植物中的转化和表达。核苷酸或氨基酸序列可以是已设计用于在生物体中表达的合成序列，所述生物体包括但不限于微生物或植物。组合物还包含含有本专利技术的核苷酸序列的细菌、植物、植物细胞、组织和种子。
[0013]特别地，提供了分本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
【国外来华专利技术】1.一种重组核酸分子，所述重组核酸分子包含编码具有杀有害生物活性的氨基酸序列的核苷酸序列，其中所述核苷酸序列选自由以下组成的组：a)SEQ ID NO:1至SEQ ID NO:18所示的核苷酸序列；b)编码包含SEQ ID NO:19至SEQ ID NO:36所示的氨基酸序列的多肽的核苷酸序列；c)编码包含与SEQ ID NO:19至SEQ ID NO:36所示的所述氨基酸序列具有至少95％序列同一性的氨基酸序列的多肽的核苷酸序列。2.一种重组核酸，所述重组核酸编码在60位、96位、97位、100位和162位中的任一者处具有经修饰的氨基酸的Axmi486多肽，其中所述多肽表现出对Hz的抗性。3.根据权利要求2所述的Axmi486多肽，其中60位处的所述经修饰的氨基酸是丙氨酸，96位处的所述经修饰的氨基酸是脯氨酸，97位处的所述经修饰的氨基酸是天冬氨酸或亮氨酸，100位处的所述经修饰的氨基酸是天冬酰胺或脯氨酸，并且162位处的所述经修饰的氨基酸是丙氨酸。4.根据权利要求1至3所述的重组核酸分子，其中所述核苷酸序列是已设计用于在植物中表达的合成序列。5.根据权利要求1至3所述的重组核酸分子，其中所述核苷酸序列可操作地连接至能够指导所述核苷酸序列在植物细胞中表达的启动子。6.一种载体，所述载体包含根据权利要求1至3所述的重组核酸分子。7.根据权利要求6所述的载体，所述载体还包含编码异源多肽的核酸分子。8.一种宿主细胞，所述宿主细胞含有根据权利要求1至3所述的重组核酸。9.根据权利要求8所述的宿主细胞，所述宿主细胞是细菌宿主细胞。10.根据权利要求8所述的宿主细胞，所述宿主细胞是植物细胞。11.一种转基因植物，所述转基因植物包含根据权利要求10所述的宿主细胞。12.根据权利要求11所述的转基因植物，其中所述植物选自由以下组成的组：玉米、高粱、小麦、卷心菜、向日葵、番茄、十字花科植物、辣椒、马铃薯、棉花、水稻、大豆、甜菜、甘蔗、烟草、大麦、和油菜。13.一种转基因种子，所述转基因种子包含根据权利要求1所述的核酸分子。14.一种具有杀有害生物活性的重组多肽，所述重组多肽选自由以下组成的组：a)包含SEQ ID NO:19至SEQ ID NO:36所示的氨基酸序列的多肽；和b)包含与SEQ ID NO:19或SEQ ID NO:36所示的所述氨基酸序列具有至少95％序列同一性的氨基酸序列的多肽。15.根据权利要求14所述的多肽，所述多肽进一步包含异源氨基酸序列。16.一种组合物，所述组合物包含根据权利要求14所述的多肽。17.根据权利要求16所述的组合物，其中所述组合物选自由以下组成的组：粉剂、粉末、丸剂、颗粒剂、喷雾剂、乳液、胶体和溶液。18.根据权利要求16所述的组合物，其中所述组合物通过细菌细胞培养物的脱水、冻干、均质化、提取、过滤、离心、沉降或浓缩来制备。19.根据权利要求16所述的组合物，所述组合物包含约1重量％至约99重量％的所述多肽。20.一种用于控制谷实夜蛾、鳞翅目、半翅目、鞘翅目、线虫或双翅目害虫种群的方法，
所述方法包括使所述种群与杀有害...

【专利技术属性】
技术研发人员：A，
申请(专利权)人：巴斯夫农业种子解决方案美国有限责任公司，
类型：发明
国别省市：