一种加帽组合物及其制备方法和体外转录反应体系技术

本发明专利技术公开了一种加帽组合物及其制备方法和体外转录反应体系，属于化学及生物工程，本申请发明专利技术人是将TRIS应用在生物酶催化体系中，所述组合物主要由加帽类似物与TRIS按照摩尔比为1:(3~7)复配的盐溶液构成，因为TRIS有比较好的生物相容性，针对一些特殊的mRNA序列进行转录时，TRIS与mRNA的生物相容性更加优异，有利于提高mRNA体外转录的效率并且可以明显提高了mRNA的加帽效率。显提高了mRNA的加帽效率。显提高了mRNA的加帽效率。

【技术实现步骤摘要】
一种加帽组合物及其制备方法和体外转录反应体系


[0001]本专利技术涉及化学及生物工程领域，尤其是涉及一种加帽组合物及其制备方法和体外转录反应体系。

技术介绍

[0002]通过体外转录合成mRNA已经成为引入外源基因病进行表达蛋白的重要工具，并广泛应用于疾病的治疗和预防中。在体外转录合成mRNA的过程中，mRNA化学法加帽的工艺是极其关键的步骤。
[0003]但应用于mRNA加帽的体系比较复杂。比如针对一些特殊的mRNA序列，加帽酶的识别效率较差，导致加帽效率较低；也有一些mRNA序列有比较多的二级结构，会导致加帽时有比较大的位阻，最终也会导致加帽效率较低。
[0004]因此，本领域迫切需要开发一类新的加帽组合物，从而使体外转录合成的mRNA能够获得更高的加帽效率。

技术实现思路

[0005]本专利技术的目的之一是提供一种加帽组合物，将TRIS应用在加帽组合物中，能够明显提高mRNA的加帽效率。
[0006]本专利技术的目的之二是提供一种加帽组合物的制备方法，实现了加帽组合物的制备，操作简便，所制备的组合物性能稳定。
[0007]本专利技术的目的之三是提供一种含有上述加帽组合物的体外转录反应体系，经转录反应合成的mRNA的加帽效率高、产量高；且相比于其他类型加帽组合物的对照组来说，在细胞蛋白表达方面提升明显。
[0008]第一方面，本申请提供一种加帽组合物，采用如下的技术方案：一种加帽组合物，所述加帽组合物主要由加帽类似物与TRIS按照摩尔比为1:(3~7)复配的盐溶液构成。
[0009]本申请专利技术人是将TRIS应用在生物酶催化体系中，具体的，是将加帽类似物与TRIS按照摩尔比为1:(3~7)的比例复配形成盐溶液，得到加帽组合物，因为TRIS有比较好的生物相容性，针对一些特殊的mRNA序列进行转录时，TRIS与mRNA的生物相容性更加优异，有利于提高mRNA转录时的产率以及明显提高了mRNA的加帽效率。
[0010]优选的，所述加帽类似物的结构式为：；
所述TRIS的结构式为：；其中，B1和B2分别为天然的或修饰的碱基；R1为H、OH、烷基、O
‑
烷基或卤素；R2为H、OH、烷基、O
‑
烷基或卤素；R3为氢、羟基、或为取代或未取代的O
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烷基、取代或未取代的S
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烷基、取代或未取代的NH
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烷基、取代或未取代的N
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二烃基、取代或未取代的O
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芳香基、取代或未取代的S
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芳香基、取代或未取代的NH
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芳香基、取代或未取代的O
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芳烷基、取代或未取代的S
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芳烷基、取代或未取代的NH
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芳烷基；R4为H、OH、或未取代的O
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烷基、取代或未取代的S
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烷基、取代或未取代的NH
‑
烷基、取代或未取代的N
‑
二烃基、取代或未取代的O
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芳香基、取代或未取代的S
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芳香基、取代或未取代的NH
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芳香基、取代或未取代的O
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芳烷基、取代或未取代的S
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芳烷基、取代或未取代的NH
‑
芳烷基；X1、X2和X3分别为O、CH2或NH；Y1、Y2和Y3分别为O、S、Se、或BH3。
[0011]优选的，所述加帽组合物的加帽效率达到98%以上。
[0012]通过采用上述技术方案，采用本申请的配方以及制备方法得到的加帽组合物，加帽效率可达98%以上；通过实验发现，采用TRIS与加帽类似物复配形成盐溶液，相比于钠盐加帽组合物或者铵盐加帽组合物来说，加帽效率明显提高，超出专利技术人的预料范围。
[0013]优选的，所述加帽组合物在体外转录mRNA时，和钠盐加帽组合物、铵盐加帽组合物相比，产量提升45%以上。
[0014]通过采用上述技术方案，采用加帽类似物与tris复配的盐溶液进行体外转录合成mRNA时，和钠盐加帽组合物、铵盐加帽组合物相比，产量提升45%以上，产量提高显著。在本申请的一些实施方式中，采用tris复配的盐溶液，合成mRNA的产量达到72μg，而采用钠盐加帽组合物或者铵盐加帽组合物，合成mRNA的产量不到50μg。
[0015]优选的，所述加帽组合物经体外转录后，和钠盐加帽组合物、铵盐加帽组合物相比，细胞内mRNA蛋白翻译效率提升1.25倍以上。
[0016]采用本申请的加帽组合物，经体外转录后，细胞内mRNA蛋白翻译效率，和钠盐加帽组合物或者铵盐加帽组合物相比，提升1.25倍以上，细胞内蛋白表达更佳，转录翻译效果更加优异。
[0017]第二方面，本申请提供一种加帽组合物的制备方法，采用如下的技术方案：一种加帽组合物的制备方法，包括如下步骤：将m7GDP咪唑盐溶解在含有MnCl2的DMF溶液中，并添加到5'
‑
磷酸化二核苷酸的DMF溶液中，在室温下搅拌反应，再经浓缩得到加帽类似物的三乙胺盐形式；将三乙胺盐形式的加帽类似物通过阳离子交换树脂转换成自由酸形式的加帽类似物；向自由酸形式的加帽类似物中滴加TRIS溶液，搅拌均匀，再经浓缩，得到加帽组合
物。
[0018]利用m7GDP咪唑盐与5'
‑
磷酸化二核苷酸制备加帽类似物的三乙胺盐形式，再将三乙胺盐形式的加帽类似物通过阳离子交换树脂转换为自由酸形式的加帽类似物，再向自由酸形式的加帽类似物中滴加TRIS溶液复配，搅拌均匀，TRIS溶液中的氨基与核苷酸中带负电荷的磷酸根进行正负电荷的配对，再经浓缩工艺，制成本申请的加帽组合物，工艺简单，在原有加帽类似物的制备工艺中添加与TRIS溶液的配对工艺，制得的终产品加帽效率高，细胞内的蛋白表达以及转录翻译效果优异。
[0019]优选的，所述TRIS盐的溶液的浓度为0.3~0.7mol/L。
[0020]通过采用上述技术方案，当TRIS盐溶液的浓度大于0.7mol/L时，会在终产品加帽组合物中残留大量的盐，会抑制生物酶的活性，降低体外转录产量以及mRNA的加帽效率；当TRIS盐溶液的浓度小于0.3mol/L时，则因TRIS盐溶液的浓度较低，导致加帽组合物无法成型。
[0021]优选的，向自由酸形式的加帽类似物中滴加TRIS盐溶液时，滴加至TRIS盐溶液达到pH为3~7。
[0022]通过采用上述技术方案，在滴加TRIS溶液时，当含有加帽组合物的溶液pH在3~7之间时，即可停止滴定，此时均可制得性能稳定的加帽组合物；如果pH>7或者pH<3时，磷酸苷上的结构点位易分解，容易造成加帽组合物性能不够稳定，不利于mRNA转录时加帽酶的活性。
[0023]第三方面，本申请提供一种体外转录反应体系，采用如下的技术方案：一种体外转录反应体系，所述体外转录反应体系中含有RNA本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种加帽组合物，其特征在于：所述加帽组合物主要由加帽类似物与TRIS按照摩尔比为1:(3~7)复配的盐溶液构成。2.根据权利要求1所述的一种加帽组合物，其特征在于：所述加帽类似物的结构式为：；所述TRIS的结构式为：；其中，B1和B2分别为天然的或修饰的碱基；R1为H、OH、烷基、O
‑
烷基或卤素；R2为H、OH、烷基、O
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烷基或卤素；R3为氢、羟基、或为取代或未取代的O
‑
烷基、取代或未取代的S
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烷基、取代或未取代的NH
‑
烷基、取代或未取代的N
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二烃基、取代或未取代的O
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芳香基、取代或未取代的S
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芳香基、取代或未取代的NH
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芳香基、取代或未取代的O
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芳烷基、取代或未取代的S
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芳烷基、取代或未取代的NH
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芳烷基；R4为H、OH、或未取代的O
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烷基、取代或未取代的S
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烷基、取代或未取代的NH
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烷基、取代或未取代的N
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二烃基、取代或未取代的O
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芳香基、取代或未取代的S
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芳香基、取代或未取代的NH
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芳香基、取代或未取代的O
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芳烷基、取代或未取代的S
‑
芳烷基、取代或未取代的NH
‑
芳...

【专利技术属性】
技术研发人员：权利要求书二页说明书九页附图四页，
申请(专利权)人：江苏申基生物科技有限公司，
类型：发明
国别省市：