一种核酸释放液及基于该核酸释放液的全血直接实时荧光PCR方法技术

本发明专利技术公开了一种核酸释放液及基于该核酸释放液的全血直接实时荧光PCR方法，核酸释放液包含40

【技术实现步骤摘要】
一种核酸释放液及基于该核酸释放液的全血直接实时荧光PCR方法


[0001]本专利技术涉及荧光PCR
，尤其是一种全血直接实时荧光PCR方法。

技术介绍

[0002]聚合酶链式反应(PCR)自从1985年问世以来，以其简单、快速、特异等优点很快受到重视，在生命科学各个领域被广泛应用。PCR扩增法的关键是DNA聚合酶，可以以模板DNA为基础，合成互补DNA链，从而实现DNA片段扩增。血液样本是PCR检测过程中最常见的样本，但是全血样本中存在大量PCR抑制因子，会抑制Taq酶的作用；因此，通常需先从全血样本中提取出基因组DNA作为模板。
[0003]目前，血液样本DNA的提取大都使用酚
‑
氯仿法、磁珠法和硅胶膜吸附柱法。酚
‑
氯仿等试剂具有很强的毒性，对操作人员身体的伤害极大，且提取效率较低、重复性较差。尽管磁珠法和硅胶柱法的DNA提取效率高，但是步骤繁琐、耗时长、成本高，而且有可能在操作中产生基因组交叉污染，从而影响最终结果。因此，若能直接将全血样本作为模板进行PCR扩增，省去提取核酸的过程，这将从时间、经济、结果准确性等多方面提高PCR检测效率。
[0004]目前，已有部分学者研究了各种实现全血直接扩增的方法。B.Mercier等人在1990年发表的一篇文献中表明，通过在PCR检测前对全血样本进行94℃加热
‑
55℃冷却的预处理，并同时对PCR缓冲液成分进行优化，可实现全血样本的直接PCR。Burckhardt J等人通过将全血样品在热循环仪中，依次在90℃和50℃温度下暴露1min并循环20次，以实现全血直接扩增。另有一些公开的全血样本预处理方法包括过氧化氢、微波辐射、甲酰胺等试剂。后续有学者通过洗去全血中红细胞，收集其中的白细胞直接作为PCR的模板，或者是加热裂解白细胞后进行PCR反应。然而这些方法与分离纯化的DNA做PCR模板相比结果要差很多。
[0005]此外，通过对DNA聚合酶的改造，提高其对样本中抑制剂的耐受性，也可实现全血样本的直接扩增。然而，目前市场上能够进行全血直扩的DNA聚合酶，大都只适合于普通PCR，反应结束后产物电泳检测，无法进行实时荧光PCR检测。这是因为全血中的抑制剂(如血红素等)会对体系中的荧光起到淬灭作用。
[0006]因此，需要在扩增前对全血样本进行简单的预处理，以去除其中的干扰物质，使得全血适用于实时荧光PCR检测。由上可以，需要研究一种前处理试剂可以抑制全血中抑制剂的干扰，同时结合耐抑制聚合酶以及PCR反应液实现全血样本直接实时PCR方法。

技术实现思路

[0007]针对现有技术存在的上述技术问题，本专利技术提供了一种核酸释放液及基于该核酸释放液的全血直接实时荧光PCR方法，使得病毒裂解更充分，提取出的病毒核酸含量更高。
[0008]本专利技术保护一种核酸释放液，包含40
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80mmol/L Tris
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HCl、0.1
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0.5％(V/V)Triton X
‑
100、0.5
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2％(V/V)Brij 58、0.05
‑
0.25mg/mL肝素、0.1
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0.3mmol/LEDTA，PH 8.6；优选的，包含75mmol/L Tris
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HCl、0.2％(V/V)Triton X
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100，0.5％(V/V)Brij 58、0.2mg/
ml肝素、0.2mmol/L EDTA，PH 8.6。
[0009]本专利技术提供的核酸释放液可快速裂解全血中白细胞。释放其中的核酸，同时可有效地吸附红细胞裂解产生的血红素，以及使得蛋白质变性，以减少这些抑制剂对后续实时荧光PCR反应的干扰。基于本专利技术提供的核酸释放液对血液样本预处理仅需要一步裂解即可，不需要反复洗脱，节省时间，操作非常方便。
[0010]本专利技术还保护基于上述核酸释放液的全血直接实时荧光PCR方法，通过上述核酸释放液对血液进行预处理，预处理方式为取适量核酸释放液与血液按照一定比例混合，裂解、离心处理；优选的，核酸释放液与血液的混合比例为1：1。
[0011]全血直接实时荧光PCR方法具体包括以下步骤：
[0012]步骤1，取一定量的全血加入到PCR反应管中；
[0013]步骤2，向PCR反应管中加入等体积核酸释放液与之混合；
[0014]步骤3，95℃裂解5min，12000rpm离心2min；
[0015]步骤4，取适量步骤3形成的混合液加入到20μL PCR反应液中；
[0016]步骤5，上机检测。
[0017]血液中添加有抗凝剂，所述抗凝剂为EDTA
‑
Na2、肝素、柠檬酸钠中的一种。
[0018]PCR反应液包含10X PCR buffer、0.48mol/L Betaine、0.5％(V/V)DMSO、0.3mmol/L dNTP、0.15U/μL耐抑制KlenTaq酶；10X PCR buffer包含500mM Tris
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HCl、160mM(NH4)2SO4、量1％Tween 20、36mmol/L Mg
2+
，pH 9.2。
[0019]实时荧光PCR试验体系含15.6μLPCR反应液、目的基因上下游引物和探针、5μL模板，双蒸水补足反应体积；实时荧光PCR反应条件：95℃预变性5min；95℃变性15s，56℃复性15s，76℃延伸30s，50个循环；在退火阶段采集通道的荧光信号，荧光PCR熔解曲线信号采集设置：95℃1min，37℃3min，之后在40℃
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85℃范围内采集相应通道的荧光信号。
[0020]与核酸释放液配套的PCR反应液包含PCR增强剂和耐抑制的聚合酶，可以对全血处理后可能残留的抑制剂进行二重抵抗，从而实现全血直接实时荧光PCR，与提取纯化后的DNA作为PCR模板的效果相差不大。
[0021]目前，市场上能够进行全血直接扩增的产品大都只能进行电泳检测，无法进行实时荧光检测，仅有的少数能进行全血实时荧光PCR方法的产品与提取纯化后的DNA做PCR模板相比均较差，可能是核酸释放剂对血红素的抑制作用较弱或者是PCR反应中未采用耐抑制DNA聚合酶导致扩增受到抑制。本专利技术将核酸释放剂、PCR增强剂、耐抑制DNA聚合酶相结合，实现对全血中抑制剂的多重抵抗及实时荧光PCR检测。与现有技术相比，本专利技术可对全血中的抑制剂进行双重抵抗，得到的结果更准确，避免由于抑制剂的影响导致的假阴性结果，且可实现大量样本的同时处理；与此同时，基于本专利技术提供的方法进行实时荧光PCR检测，可避免琼脂糖凝胶电泳可能带来的污染。此外，本专利技术操作简便、节省时间、成本低廉等优点。
附图说明
[0022]图1是CYP2C19*3(rs12248560)位点(简称CYP3位点)40个全血样本检测结果图；其中a为熔解曲线，b为纯合本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种核酸释放液，其特征在于，包含40
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80mmol/L Tris
‑
HCl、0.1
‑
0.5％(V/V)Triton X
‑
100、0.5
‑
2％(V/V)Brij 58、0.05
‑
0.25mg/mL肝素、0.1
‑
0.3mmol/L EDTA，PH 8.6。2.根据权利要求1所述的用于核酸提取的核酸释放液，其特征在于，包含75mmol/L Tris
‑
HCl、0.2％(V/V)Triton X
‑
100，0.5％(V/V)Brij 58、0.2mg/ml肝素、0.2mmol/L EDTA，PH 8.6。3.一种全血直接实时荧光PCR方法，其特征在于，通过权利要求1或2所述的核酸释放液对血液进行预处理，预处理方式为取适量核酸释放液与血液按照一定比例混合，裂解、离心处理。4.根据权利要求3所述的全血直接实时荧光PCR方法，其特征在于，核酸释放液与血液的混合体积比例为1：1。5.根据权利要求4所述的全血直接实时荧光PCR方法，其特征在于，具体包括以下步骤：步骤1，取一定量的核酸释放液加入到PCR反应管中；步骤2，向PCR反应管中加入等量血液与之混合；步骤3，95℃裂解5min，12000rpm离心2min；步骤4，取适量步骤3形成的...

【专利技术属性】
技术研发人员：王美玲，夏婷婷，徐红梅，卢德景，夏梦凡，周艳雷，杨芳梅，修朝阳，高强，郑宝富，
申请(专利权)人：合肥欧创基因生物科技有限公司，
类型：发明
国别省市：