鉴定耐咪唑啉酮类除草剂油菜的KASP标记引物、试剂盒及其应用制造技术

本发明专利技术公开了鉴定耐咪唑啉酮类除草剂油菜的KASP标记引物、试剂盒及其应用，涉及作物分子遗传育种技术领域。本发明专利技术的KASP标记引物组包括用于检测AHSH1基因的KASP标记引物组BN

【技术实现步骤摘要】
鉴定耐咪唑啉酮类除草剂油菜的KASP标记引物、试剂盒及其应用


[0001]本专利技术涉及作物分子遗传育种
，特别涉及鉴定耐咪唑啉酮类除草剂油菜的KASP标记引物、试剂盒及其应用。

技术介绍

[0002]油菜是一种主要的油料作物，杂草对油菜的生产危害十分大，在生产上常使用化学农药除草剂去除油菜田中的杂草。加拿大、澳大利亚等油菜生产国已经大面积推广和使用抗除草剂油菜，与不具抗除草剂能力的油菜相比，抗除草剂的油菜能够提高化学农药对油菜种植中的杂草防治效率，降低防治杂草的成本，减少对环境的危害，并使得油菜产量或经济回报更大。选育对特定除草剂具有抗性的油菜品种对我国油菜生产具有重要的意义。
[0003]乙酰羟基酸合酶(acetohydroxyacid synthase，AHAS)又称乙酰乳酸合酶(acetolactate syn
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thase，ALS)，是支链氨基酸合成起始酶，对植物的生长发育起着重要的作用。AHAS抑制剂类除草剂是以AHAS为靶标开发的除草剂，主要作用机制是通过植物叶片、根茎等部位吸收，与AHAS形成复合物，使支链氨基酸合成受阻，进而影响蛋白质的合成，使植物逐渐黄化、死亡。AHAS抑制剂类除草剂包括磺酰脲类(Sulfonylureas)、咪唑啉酮类(Imidazolinones)、三唑嘧类(Triazolopyrimidines)、嘧啶硫代苯甲酸类(Pyrimidinylthiobenzoates)和磺酰胺羰基三唑啉酮类(Sulfonylamino carbonyltriazolinones)等五类，其中磺酰脲类(Sulfonylureas)和咪唑啉酮类(Imidazolinones)使用最多。
[0004]相关技术中，AHAS1基因第653位密码子发生G/A突变，丝氨酸(Ser)突变为天冬氨酸(Asp)，该SNP位点命名为PM1；AHAS3基因第574位密码子发生G/T突变，色氨酸(Trp)突变为亮氨酸(Leu)，该SNP位点命名为PM2；当PM1和PM2突变堆叠且纯合时，对咪唑啉酮除草剂的耐受性最高。而由于AHAS基因的多拷贝特性，现在文章和专利中筛选相关抗性油菜的分子标记都基于上述SNP位点的SSCP或者CAPS标记，在一定程度上避免了多拷贝的干扰，但SSCP或者CAPS标记通量低，费用高，技术复杂，且耗时，因此一般育种很少用SSCP或者CAPS标记筛选，而直接用除草剂进行筛选。
[0005]因此，亟需开发一种检测通量高、特异性强、成本低的鉴定耐咪唑啉酮类除草剂油菜的方法。

技术实现思路

[0006]本专利技术旨在至少解决现有技术中存在的技术问题之一。为此，本专利技术提出一组KASP标记引物组，该组KASP标记引物组灵敏性高、特异性高，能够准确鉴定油菜AHAS1基因及AHAS3基因中PM1和PM2的SNP突变位点。
[0007]本专利技术还提出含上述KASP标记引物组的试剂盒。
[0008]本专利技术还提出含上述KASP标记引物组的基因芯片。
[0009]本专利技术还提出上述KASP标记引物组在鉴定或辅助鉴定耐除草剂油菜中的应用。
[0010]本专利技术还提出上述KASP标记引物组在油菜种质资源改良中的应用。
[0011]本专利技术还提出一种基于上述KASP标记引物组的耐除草剂油菜的鉴定方法。
[0012]本专利技术的第一个方面，提供包括用于检测AHSH1基因的KASP标记引物组BN
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PM1.1和BN
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PM1.2，用于检测AHSH3基因的KASP标记引物组BN
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PM2.1和BN
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PM2.2；所述BN
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PM1.1的两条特异性引物Primer X1和Primer Y1的核苷酸序列分别如SEQ ID NO.3和SEQ ID NO.4所示；所述BN
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PM1.2的两条特异性引物Primer X2和Primer Y2的核苷酸序列分别如SEQ ID NO.6和SEQ ID NO.7所示；所述BN
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PM2.1的两条特异性引物Primer X7和Primer Y7的核苷酸序列分别如SEQ ID NO.18和SEQ ID NO.19所示；所述BN
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PM2.2的两条特异性引物Primer X8和Primer Y8的核苷酸序列分别如SEQ ID NO.21和SEQ ID NO.22所示。
[0013]在本专利技术的一些实施方式中，所述BN
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PM1.1和所述BN
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PM1.2用于检测AHSH1基因第653位密码子非保守碱基的G/A突变。
[0014]在本专利技术的一些实施方式中，所述BN
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PM2.1和所述BN
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PM2.2用于检测AHSH3基因第574位密码子非保守碱基的G/T突变。
[0015]在本专利技术的一些实施方式中，所述KASP标记引物组还包括通用引物；所述BN
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PM1.1的通用引物Primer C1的核苷酸序列如SEQ ID NO.5所示；所述BN
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PM1.2的通用引物Primer C2的核苷酸序列如SEQ ID NO.8所示；所述BN
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PM2.1的通用引物Primer C7的核苷酸序列如SEQ ID NO.20所示；所述BN
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PM2.2的通用引物Primer C8的核苷酸序列如SEQ ID NO.23所示。
[0016]AHAS1基因第653位密码子发生G/A突变，丝氨酸(Ser)突变为天冬氨酸(Asp)，该SNP位点命名为PM1；AHAS3基因第574位密码子发生G/T突变，色氨酸(Trp)突变为亮氨酸(Leu)，该SNP位点命名为PM2。当PM1和PM2均突变且纯合，或PM1和PM2均突变且杂合时，油菜耐受咪唑啉酮类除草剂；当PM1和PM2均突变且纯合时，油菜对咪唑啉酮类除草剂的耐受性最高。
[0017]在本专利技术的一些实施方式中，所述Primer X1和所述Primer Y1分别连接不同的荧光接头序列；所述Primer X2和所述Primer Y2分别连接不同的荧光接头序列；所述Primer X7和所述Primer Y7分别连接不同的荧光接头序列；所述Primer X8和所述Primer Y8分别连接不同的荧光接头序列。
[0018]在本专利技术的一些实施方式中，所述Primer X1和所述Primer Y1的5
’
端分别连接不同的荧光接头序列；所述Primer X2和所述Primer Y2的5
’
端分别连接不同的荧光接头序列；所述Primer X7和所述Primer Y7的5
’
端分别连接不同的荧光接头序列；所述Primer X8和所述Primer Y8的5
’
端分别连接不同的荧光接头序列。
[0019]在本专利技术的一些实施方式中，所述荧光接头序列本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一组KASP标记引物组，其特征在于，包括用于检测AHSH1基因的KASP标记引物组BN
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PM1.1和BN
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PM1.2，用于检测AHSH3基因的KASP标记引物组BN
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PM2.1和BN
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PM2.2；所述BN
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PM1.1的两条特异性引物Primer X1和Primer Y1的核苷酸序列分别如SEQ ID NO.3和SEQ ID NO.4所示；所述BN
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PM1.2的两条特异性引物Primer X2和Primer Y2的核苷酸序列分别如SEQ ID NO.6和SEQ ID NO.7所示；所述BN
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PM2.1的两条特异性引物Primer X7和Primer Y7的核苷酸序列分别如SEQ ID NO.18和SEQ ID NO.19所示；所述BN
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PM2.2的两条特异性引物Primer X8和Primer Y8的核苷酸序列分别如SEQ ID NO.21和SEQ ID NO.22所示。2.根据权利要求1所述的KASP标记引物组，其特征在于，所述KASP标记引物组还包括通用引物；所述BN
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PM1.1的通用引物Primer C1的核苷酸序列如SEQ ID NO.5所示；所述BN
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PM1.2的通用引物Primer C2的核苷酸序列如SEQ ID NO.8所示；所述BN
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PM2.1的通用引物Primer C7的核苷酸序列如SEQ ID NO.20所示；所述BN
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PM2.2的通用引物Primer C8的核苷酸序列如SEQ ID NO.23所示。3.根据权利要求1所述的KASP标记引物组，其特征在于，所述Primer X1和所述Primer Y1分别连接不同的荧光接头序列；所述Primer X2和所述Primer Y2分别连接不同的荧光接头序列；所述Primer X7和所述Primer Y7分别连接不同的荧光接头序列；所述Primer X8和所述Primer Y8分别连接不同的荧光接头序列。4.根据权利要求3所述的KASP标记引物组，其特征在于，所述荧光接头序列为FAM荧光接头序列或HEX荧光接头序列。5.一种试剂盒，其特征在于，所述试剂盒包括权利要求1
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4任一项所述的KASP标记引物组。6.一种基因芯片，其特征在于，所述基因...

【专利技术属性】
技术研发人员：雷雨婷，唐顺学，田冰川，谢心悦，
申请(专利权)人：华智生物技术有限公司，
类型：发明
国别省市：