本发明专利技术提供的一种同时定量检测EHV
【技术实现步骤摘要】
一种同时定量检测EHV-1和EHV-4的检测试剂盒及其应用
[0001]本专利技术涉及病毒检测领域，具体涉及马疱疹病毒的检测方法及其应用，更具体的涉及EHV-1和EHV-4病毒检测的试剂盒及其应用。
技术介绍
[0002]马鼻肺炎(Equine rhinopneumonitis，ER)是由疱疹病毒科 (Herpesviridae)的马疱疹病毒1型(Equine herpesvirus1，EHV-l)和马疱疹病毒4型(Equine herpesvirus4，EHV-4)引起的一种急性、发热性传染病。EHV-l能引起不同程度的神经症状和高死亡率的马脑脊髓炎，以及怀孕母马流产，马驹死亡；EHV-4在世界范围内是引起马呼吸道疾病的主要原因；这两种病毒的病原体对养马业造成了严重的危害。早期诊断和加强饲养管理是预防关键。ER的两种病原体间存在血清交叉反应，建立诊断及分型研究方法有利于马鼻肺炎的防控。
[0003]现有技术中，申请号为201410042034.7的专利技术专利中提供了一种一种用于检测I型和IV型马疱疹病毒的双重Evay Green实时荧光定量PCR检测试剂盒及其应用，EHV-1和EHV-4的检出率均为 76.9％(10/13)且检测结果需要结合标准曲线及琼脂糖凝胶检测，过程复杂。申请号为201310690472.X的专利技术专利中提供了一种鉴别马疱疹病毒1/4型的Lamp检测引物及方法，结果也需依赖琼脂糖凝胶检测，且披露具体的检测准确率，但本
常规技术人员熟知 LAMP技术引物设计较复杂,而且在稳定性和准确率等方面与常规PCR相比还有一定的差距。
技术实现思路
[0004]针对现有技术中存在的不足问题，本专利技术的目的在于提供一种同时定量检测EHV-1和EHV-4的检测试剂盒及其应用，以达到早期诊断、治疗、风险分层和预后评估。
[0005]本专利技术通过以下技术方案实现的：
[0006]本专利技术提供一种同时定量检测EHV-1和EHV-4的检测试剂盒，含有QuantStudio 3D数字PCR反应试剂，所述的试剂盒中含有用于检测EHV-1和EHV-4的双重反应液，其中所述的双重反应液中含有用于检测EHV-1的引物；包含用于检测EHV-4的引物对，核苷酸序列如SEQ ID NO.1及SEQ ID NO.2所示；还包含用于检测EHV-4的经VIC标记的探针对，核苷酸序列如SEQ ID NO.3所示。
[0007]其中所述的检测EHV-1的引物及经FAM标记的探针选用《马疱疹病毒1型QuantStudio
TM 3D数字PCR检测方法的建立与应用》文章中披露的EHV-1相关检测引物及探针。
[0008]优选的，所述的双重反应液中各引物及探针的浓度分别设置为 0.1μmol/L～0.7μmol/L。
[0009]更优选的，EHV-1引物最优浓度为0.4μmol/L，EHV-4引物最优浓度为0.4μmol/L。
[0010]更优选的，EHV-1探针最优浓度为0.27μmol/L，EHV-4探针最优浓度为0.27μmol/L。
[0011]本专利技术提供的一种同时定量检测EHV-1和EHV-4的检测试剂盒，用于检测EHV-1和EHV-4的dPCR反应条件为：96℃10min； (56℃-64℃)2min，98℃30s，共39个循环；60℃，2min，10℃保存。
[0012]优选的，用于检测EHV-1和EHV-4的dPCR反应条件为：96℃ 10min；60℃2min，98℃30s,共39个循环；60℃，2min；10℃保存。
[0013]本专利技术还提供一种同时定量检测EHV-1和EHV-4的检测试剂盒在制备用于同时检测EHV-1和EHV-4的试剂中的应用。
[0014]本专利技术提供一种同时定量检测EHV-1和EHV-4的引物组，含有用于检测EHV-1及EHV-4的引物对，其中，用于检测EHV-1的引物对的核苷酸序列如《马疱疹病毒1型QuantStudio
TM 3D数字PCR检测方法的建立与应用》文章中所示，用于检测EHV-4的引物对的核苷酸序列如SEQ ID NO.1及SEQ ID NO.2所示。
[0015]本专利技术提供一种同时定量检测EHV-1和EHV-4的探针组，含有用于检测EHV-1及EHV-4的探针对，其中，用于检测EHV-1的探针对的核苷酸序列如《马疱疹病毒1型QuantStudio
TM 3D数字PCR检测方法的建立与应用》文章中所示，用于检测EHV-4的探针对的核苷酸序列如SEQ ID NO.3所示。
[0016]同时，本专利技术还提供了一种同时定量检测EHV-1和EHV-4的检测试剂盒的引物组及探针合物在制备检测EHV-1和EHV-4的试剂中的应用。
[0017]所述一种同时定量检测EHV-1和EHV-4的检测试剂盒中还包括QuantStudio 3D数字PCR反应常用试剂和其它一些辅助试剂，这些试剂的特性以及它们的配制方法均是本领域技术人员所熟知的；在本专利技术的具体实施方案中，使用了QuantStudio 3D数字PCR的方法。
[0018]本专利技术提供一种同时定量检测EHV-1和EHV-4的检测试剂盒。通过实施本专利技术具体的
技术实现思路
，可以达到以下有益效果：
[0019]本专利技术提供的一种同时定量检测EHV-1和EHV-4的检测试剂盒及其应用，具有高度的特异性且显著提高检测的准确性。并能够避免试验中可能出现的污染，并对临床样本中的病毒含量进行绝对定量，为 EHV-1、EHV-4感染早期病毒含量较低时的检测提供新的技术，适用于马鼻肺炎的早期诊断、潜伏感染甄别及流行病学调查。
附图说明
[0020]图1所示为灵敏度检测结果图。
[0021]其中图中所示EHV-1，EHV-4各1μL质粒浓度分别为104copies/μL 图2所示为灵敏度检测结果图。
[0022]其中图中所示EHV-1，EHV-4各1μL质粒浓度分别为 103copies/μL
[0023]图3所示为灵敏度检测结果图。
[0024]其中图中所示EHV-1，EHV-4各1μL质粒浓度分别为 102copies/μL
[0025]图4所示为灵敏度检测结果图。
[0026]其中图中所示EHV-1，EHV-4各1μL质粒浓度分别为 101copies/μL
[0027]图5所示为灵敏度检测结果图。
[0028]其中图中所示EHV-1，EHV-4各1μL质粒浓度分别为 100copies/μL
[0029]图6所示为特异性检测结果图。
具体实施方式
[0030]下面，举实施例说明本专利技术，但是，本专利技术并不限于下述的实施例。
[0031]本专利技术中材料及试剂有：EHV-1、EHV-4、马泰勒虫、马动脉炎病毒的核酸均由乌鲁木齐海关技术中心保存，DNA/RNA提取试剂盒、质粒提取试剂盒均购自TaKaRa公司，QuantStudio
TM 3D Dig本文档来自技高网...
【技术保护点】
【技术特征摘要】
1.一种同时定量检测EHV-1和EHV-4的检测试剂盒，含有QuantStudio 3D数字PCR反应试剂，其特征在于，所述的试剂盒中含有用于检测EHV-1和EHV-4的双重反应液，其中所述的双重反应液中含有用于检测EHV-1的引物；还包含用于检测EHV-1的经FAM标记的探针对；包含用于检测EHV-4的引物对，核苷酸序列如SEQ ID NO.1及SEQ ID NO.2所示；还包含用于检测EHV-4的经VIC标记的探针对，核苷酸序列如SEQ ID NO.3所示。2.如权利要求1所述的一种同时定量检测EHV-1和EHV-4的检测试剂盒，其特征在于，所述的双重反应液中各引物及探针的浓度分别设置为0.1μmol/L～0.7μmol/L。3.如权利要求2所述的一种同时定量检测EHV-1和EHV-4的检测试剂盒，其特征在于，EHV-1引物最优浓度为0.4μmol/L，EHV-4引物最优浓度为0.4μmol/L 。4.如权利要求3所述的一种同时定量检测EHV-1和EHV-4的检测试剂盒，其特征在于，EHV-1探针最优浓度为0.27μmol/L，EHV-4探针最优浓度为0.27μmol/L。5.如权利要求1-4任一项所述的一种同时定量检测EHV-1和EH...
【专利技术属性】
技术研发人员：王科珂，陈凯云，蒋刚强，王振宝，徐新峰，雷程红，肖媛媛，白梅花，李学文，胡都斯，
申请(专利权)人：乌鲁木齐海关技术中心，
类型：发明
国别省市：
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