一种双酚AF半抗原的制备方法及应用技术

一种双酚AF半抗原，结构如下式(I)所示。本发明专利技术制备得了一种双酚AF半抗原，动物免疫后结果显示，该半抗原结构偶联蛋白后制得的抗原进行免疫，更易于诱导产生亲和力和灵敏度俱佳的单克隆抗体。将该性能优异的单克隆抗体用于制备免疫亲和柱，高效净化12类不同食品中的双酚AF，配合超高效液相色谱串联质谱进行检测，建立快速、灵敏度高、精密度好和净化效果卓越的痕量检测方法。以本发明专利技术双酚AF半抗原最终制备得到的免疫亲和柱用于双酚AF的检测，灵敏度和准确性高，LOD和LOQ低，可以用于复杂基质，比如食品中特异性地痕量双酚AF的快速、准确的检测。（I）。（I）。（I）。

【技术实现步骤摘要】
一种双酚AF半抗原的制备方法及应用


[0001]本申请涉双酚衍生物检测领域，具体涉及一种双酚AF半抗原的制备方法及应用。

技术介绍

[0002]随着现代工业化进程的推进，大量的化学物质被排放入环境，其中一些化学物质能模拟或干扰内分泌系统并对人类和野生动物的生殖与发育等造成危害，因此被称为“内分泌干扰物”。2012年世界卫生组织已经将70多种化学物质列入内分泌干扰物的范畴，其中的双酚A [学名：2，2
‑
二（4
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羟基苯基）丙烷；Bisphenol A, BPA]是已被证实的典型内分泌干扰物。在工业上BPA被用来合成聚碳酸酯和环氧树脂等材料。广泛的应用于食品包装材料、食品贮藏容器以及工业洗涤剂、塑料增塑剂和稳定剂等，并且已经在各种食品和环境基质（如水产品、水体、土壤和沉积物）中都检测到BPA的存在。人类通过摄入被污染的食品而暴露于这类物质中，据报道人体的尿液、血清和母乳中都存在着不同水平的BPA。随着不含BPA商品的需求量不断增加以及相关部门对使用BPA的限制，拥有两个酚环结构的BPA类似物由于其物理、化学性质与BPA类似，出现在人们的视野中。双酚AF，又名BPAF，作为BPA的替代物在工业生产中使用。BPAF [学名：2,2'
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二(4
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羟基苯基)
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六氟丙烷）]用于电子纤维、光学纤维的交联剂，制备聚酰亚胺、聚酰胺和聚碳酸酯等时所用的单体。有研究表明，即使在每日允许摄入量的1/1000暴露水平，BPAF依然能对大脑发育和行为产生可测量的危害效应，该研究利用斑马鱼做模式生物，为低剂量的BPAF不利于大脑发育并引起多动症的有关机制提供了证据。还有文献表明，微量的BPAF会诱导乳腺癌细胞、前列腺细胞增殖，降低学习记忆能力而且不可恢复。同时，相关研究也证实，BPAF同样具有不弱于BPA的雌激素活性，还具有较强的抗雄性激素活性，与雌激素受体结合，产生类雌激素效应，有研究表明水体中微量的双酚AF会对雄性斑马鱼的甲状腺组织和激素水平产生影响，因此BPAF作为BPA替代物的产品也不能消除健康风险。通过与含BPAF的食品包装材料或日用品接触以及从被污染的土壤、空气和水等发生迁移，BPAF可以迁移并富集到包装的食品以及食品原材料中。现有研究表明，BPA及其类似物BPAF在各类食物中广泛存在，浓度水平多为μg/kg水平。
[0003]因此对食物中BPAF的污染水平进行准确测定对于监测BPAF对人群健康风险是非常必要的。当前关于食品中BPAF测定的主要前处理方法有液
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液萃取法、固相萃取法等，液相色谱串联质谱或气相色谱质谱法检测。
[0004]专利CN102692474A公开了一种食品中双酚AF的快速检测方法，其是以离子液体为萃取剂，之后分离得到萃取液后进行HPLC的定量分析，但是该方法的灵敏度低，适用的食品种类少。而且离子液体作为萃取液，会极大提升检测的成本，并不经济，不利于产业化。
[0005]由于食品样品成分复杂，以上的净化方法选择性差、操作繁琐，针对不同的食品样品常需要多种净化手段才可达到检测目的，净化效果也直接影响测定方法的灵敏度和准确度。因此有必要利用抗原
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抗体的特异性结合反应，开发净化效果卓越的免疫亲和色谱技术。抗体是免疫亲和色谱技术和免疫分析方法的关键试剂。直接决定分离净化效果和分析方法的特异性和灵敏度等。专利CN109425734A公开了一种双酚A及其类似物的半抗原，其中
化合物作为双酚AF的半抗原，用于制备免疫亲和柱。但用于检测双酚AF，特别是在复杂基质中双酚AF，检测限还比较高，比如对于食品中痕量的双酚AF，结果还不能令人满意。

技术实现思路

[0006]目前还缺乏特异性强，灵敏度高的BPAF单克隆抗体，严重制约BPAF免疫亲和色谱技术的开发。本专利技术提供了一种BPAF半抗原和抗原的制备方法，以此结构制备的半抗原和抗原得到的单克隆抗体，特异性强、灵敏度高，经过试验验证，可以适用于12种复杂食品样品中BPAF的净化和富集，结合超高效液相色谱串联质谱检测技术，可对食品中痕量的BPAF进行快速、准确的测定。
[0007]本专利技术首先提供了一种双酚AF半抗原，结构如下式(I)所示： （I）。
[0008]本专利技术还提供了所述双酚AF半抗原的制备方法，合成路线如下：
。
[0009]进一步地，所述双酚AF半抗原的制备方法，包括以下步骤：(S1)将双酚AF用氢化钠处理后，加入4
‑
溴甲基
‑
2,6
‑
二甲基苯甲酸甲酯，反应结束后，萃取，层析柱纯化得中间体；(S2)所得中间体先在碱性条件下进行水解，再用酸调节至酸性，反应结束后萃取，干燥即得。
[0010]进一步地，步骤(S1)中，双酚AF和4
‑
溴甲基
‑
2,6
‑
二甲基苯甲酸甲酯的摩尔比为1:1
‑
1.2。
[0011]进一步地，步骤(S1)中，所述氢化钠处理是双酚AF用氢化钠处理是将双酚AF溶于DMF后，冰浴条件下加入氢化钠，待不再有气泡冒出时撤去冰浴，在15
‑
30℃反应0.5
‑
1h，双酚AF 和氢化钠的摩尔比为1：1.1
‑
2。
[0012]进一步地，步骤(S1)中，所述萃取是反应液加入到水中，再用加入乙酸乙酯萃取，萃取操作重复1
‑
2次。层析柱纯化的操作和条件为本领域所熟知，在一个具体实施方式中，样品上样硅胶柱，用石油醚和乙酸乙酯按照体积比1
‑
2:1
‑
2的混合溶剂作为淋洗剂，收集目标产物，旋干溶剂即得中间体。
[0013]进一步地，步骤(S2)中，碱性条件是加入碱，所述碱为氢氧化钠，氢氧化钾中的至少一种，碱的加入量是中间体的1.5
‑
2倍当量。所述调节pH为酸性是调节pH为2
‑
3，酸为盐酸、硫酸中的至少一种。所述萃取是加入乙酸乙酯、氯仿、二氯甲烷、四氢呋喃中的至少一种进行萃取。
[0014]本专利技术还提供了一种双酚AF人工抗原，是以式(I)所述的双酚AF半抗原经过活化后，和载体蛋白偶联，经过透析、离心得到，所述双酚AF人工抗原如下式(II)所示：
ꢀ
(II)。
[0015]进一步地，所述活化是加入EDC和NHS，在15
‑
25℃，避光条件下活化15
‑
30h；所述半抗原、EDC和NHS的摩尔比为1：2
‑
3：2
‑
3。
[0016]进一步地，所述双酚AF半抗和载体蛋白的摩尔比为10
‑
30:1，所述载体蛋白包括牛血清蛋白、人血清蛋白、牛甲状腺蛋白、血匙蓝蛋白或卵清蛋白。偶联反应条件是温度15
‑
25℃，pH为6
‑
8，反应时间12...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种双酚AF半抗原，其特征在于，结构如下式(I)所示： （I）。2.根据权利要求1所述的双酚AF半抗原的制备方法，其特征在于，合成路线如下：。3.根据权利要求2所述的双酚AF半抗原的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：(S1)将双酚AF用氢化钠处理后，加入4
‑
溴甲基
‑
2,6
‑
二甲基苯甲酸甲酯，反应结束后，萃取，层析柱纯化得中间体；(S2)所得中间体先在碱性条件下进行水解，再用酸调节至酸性，反应结束后萃取，干燥即得。4.根据权利要求3所述的双酚AF半抗原的制备方法，其特征在于，步骤(S1)中，双酚AF和4
‑
溴甲基
‑
2,6
‑
二甲基苯甲酸甲酯的摩尔比为1:1
‑
1.2。5.根据权利要求3所述的双酚AF半抗原的制备方法，其特征在于，步骤(S1)中，所述氢化钠处理是双酚AF用氢化钠处理是将双酚AF溶于DMF后，冰浴条件下加入氢化钠，待不再有气泡冒出时撤去冰浴，在15
‑
30℃反应0.5
‑
1h，双酚AF 和氢化钠的摩尔比为1：1.1
‑
2；步骤(S1)中，所述萃取是反应液加入到水中，再用加入乙酸乙酯萃取，萃取操作重复1
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2次；
层析柱纯化是样品上样硅胶柱，用石油醚和乙酸乙酯按照体积比1
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2:1
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2的混合溶剂作为淋洗剂，收集目标产物，旋干溶剂即得中间体；步骤(S2)中，碱性条件是加入碱，所述碱为氢氧化钠，氢氧化钾中的至少一种，碱的加入量是中间体的1.5<...

【专利技术属性】
技术研发人员：邵兵，姚凯，张晶，尹杰，杨蕴嘉，
申请(专利权)人：北京市疾病预防控制中心，
类型：发明
国别省市：