一种3D乳腺癌细胞的体外快速培养方法技术

本发明专利技术属于细胞培养技术领域，公开了一种3D乳腺癌细胞的体外快速培养方法。将液氮储存的MCF

【技术实现步骤摘要】
一种3D乳腺癌细胞的体外快速培养方法


[0001]本专利技术属于细胞培养
，具体涉及一种3D乳腺癌细胞的体外快速培养方法。

技术介绍

[0002]在世界范围内，乳腺癌的发病率和死亡率居高不下。因此，探索有效的乳腺癌治疗药物 仍然十分重要。在这过程中，为抗癌药物的安全性和有效性测试提供重要参考结果的研究工 具的需求也越来越大。
[0003]传统上，可以使用动物模型和二维培养系统作为标准，检测抗癌药物对肿瘤的抑制作用。 然而，动物模型需要牺牲大量动物，不适合进行高通量抗癌药物筛选，而二维培养系统产生 的结果往往与临床结果相似性较低。由于三维培养系统可以模拟肿瘤微环境，正逐渐取代动 物和二维培养模型，用于筛选处于开发初期的抗肿瘤药物。研究表明，与二维培养的癌细胞 相比，三维模型中的癌细胞往往表现出更强的耐药性，可以解释实验与临床上药物反应的差 异。同时，扩大这项技术的应用范围也有益于减少为研究而牺牲的动物数量。
[0004]至2009年SATO等首先使用小鼠肠道干细胞培育出肠类器官3D细胞模型起，3D培养 技术逐渐发展出多种培养方法。目前常规培养3D细胞有多种方法，包括微流体培养法、胶 原凝胶培养法、微载体珠法、支架基培养法和悬滴培养等。微流体培养法能够精细控制细胞 培养的微环境，但操作复杂，需要特定仪器与定制耗材；基于Matrigel的3D培养模型主要 适用于肠类器官等培养，形成的3D细胞往往是非球形，也缺乏均匀性；微载体珠法操作相 对简单且培养基利用率较高，但形成的3D肿瘤细胞缺少中间坏死区等结构；在以固体支架 为基础的细胞培养系统中，支架可以促进细胞之间的增殖、细胞粘附和信号传导活动，但需 要特定支架，造价不菲；悬滴培养由于难以更换培养基，培养时间有较大限制。
[0005]专利CN 112760289 A公开了一种乳腺癌类器官专用培养基及3D培养方法。该培养基包 括基础培养基和特异性添加因子，培养方法包括：将分离的乳腺癌组织进行预处理后消化并 过滤，得到细胞沉淀；将细胞沉淀裂解，然后与matrigel胶混匀并接种，待混合胶凝固后加 入上述培养基，并于37℃、5％CO2浓度下培养7～14天。该专利虽然得到了球形规则，且大 小较为均一的肿瘤类器官细胞球，但需要使用特制的培养基(需要添加特异性添加因子，还 包括重组蛋白)，培养基成本高，且操作复杂。
[0006]因此，本领域期待提供一种新的方法来培养3D乳腺癌细胞，尤其能显著提高3D乳腺癌 细胞培养效率、操作简单且成本较低的技术途径。

技术实现思路

[0007]针对以上现有技术存在的缺点和不足之处，本专利技术的目的在于提供一种3D乳腺癌细胞 的体外快速培养方法。本专利技术方法在现有的通用肿瘤细胞培养技术的基础上，对有关技术进 行改进，以适应对3D乳腺癌细胞的体外快速培养的需要，配合使用超低吸附细胞培
养板培 养细胞，实现3D乳腺癌细胞的体外快速培养。
[0008]本专利技术目的通过以下技术方案实现：
[0009]一种3D乳腺癌细胞的体外快速培养方法，包括如下步骤：
[0010](1)复苏MCF
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7贴壁细胞：将液氮储存的MCF
‑
7细胞经解冻后加入完全培养基混匀， 得到细胞混悬液，然后将细胞混悬液转移到培养皿中，放入二氧化碳培养箱培养；
[0011](2)消化贴壁细胞：将步骤(1)培养后的细胞用PBS溶液清洗，然后加入消化液消化， 使细胞脱落后加入完全培养基离心，去上清液，再加入3D培养基，所得细胞混悬液转移到 超低吸附细胞培养板上，放入二氧化碳培养箱培养；
[0012](3)3D细胞培养：每天观察细胞状态，每1～2天更换1/2的3D培养基，培养至显微镜 下观察到形成大小均一，细胞间间隔不明显，紧密的MCF
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7细胞球，确认3D乳腺癌细胞的 体外培养成功。
[0013]进一步地，步骤(1)中所述解冻程序为：立即放入37℃的水浴中，轻轻旋转小于1分 钟快速解冻细胞。
[0014]进一步地，步骤(1)中所述加入完全培养基混匀前，先加入适量预热的完全培养基，吹 打悬匀，以800r/min离心5～10分钟，去上清液。
[0015]进一步地，步骤(1)中所述二氧化碳培养箱培养的条件为：5％CO2(v/v)，37℃，饱 和湿度。
[0016]进一步地，步骤(1)和步骤(2)中所述完全培养基是以DMEM高糖培养基为基质配制 并包含：体积分数10％胎牛血清、1％双抗。进一步地，步骤(2)中所述PBS溶液清洗次数 为2次。
[0017]进一步地，步骤(2)中所述加入消化液消化的流程为：在培养皿侧面加入消化液，轻轻 摇动培养皿，以获得完全覆盖的细胞层，室温下静置2分钟。
[0018]进一步地，步骤(2)中所述离心是指以800r/min离心5～10分钟。
[0019]进一步地，步骤(2)中所述超低吸附细胞培养板为商品化产品(美国康宁公司)，其上 覆盖低细胞结合特性的生物材料，可以防止细胞粘附在表面，使细胞自发形成球体。
[0020]进一步地，步骤(2)和步骤(3)中所述3D培养基是以完全培养基为基质配制并添加 体积分数0.5％～2.0％的Matrigel胶。
[0021]进一步地，步骤(3)中所述培养的时间为5～7天。
[0022]与现有技术相比，本专利技术的有益效果是：
[0023](1)快速：支架基培养法和悬滴培养等3D细胞培养方法的培养时间均在14天或以上， 本专利技术提供的3D乳腺癌细胞的体外快速培养方法可以把时间大大缩短至5～7天即可。
[0024](2)简单：微流体培养法等操作繁琐并且容易污染，胶原凝胶培养法操作相对简单但需 要先在培养板上铺胶原凝胶并且培养基配方复杂，本专利技术提供的3D乳腺癌细胞的体外快速 培养方法，基于肿瘤细胞培养技术，操作与培养基配方都接近普通肿瘤细胞培养，简单易行。
[0025](3)便宜：微流体培养法等方法需要特定仪器与定制耗材，造价不菲，本专利技术提供的 3D乳腺癌细胞的体外快速培养方法，采用商品化的超低吸附细胞培养板，可以大大降低实验 成本。
[0026](4)本专利技术采用常规培养基(以完全培养基为基质配制并添加体积分数0.5％
后加入适量完全培养基以800r/min离心10分钟；去上清液，加入3D培养基(以完全培养基 为基质配制并添加体积分数2.0％的Matrigel胶)，细胞混悬液转移到超低吸附细胞培养板上， 放入二氧化碳培养箱培养。
[0039](3)3D细胞培养：每天观察细胞状态；每天更换1/2培养基。第5天可以显微镜下观 察到MCF
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7细胞已经形成紧密的细胞球，大小相对均一，细胞间间隔不明显。
[0040]上述实施例为本专利技术较佳的实施方式，但本专利技术的实施方式并不受上述实施例的限制， 其它的任何未背离本专利技术的精神实质与原理下所作的改变、修饰、替代、组合、简化，均应 为等效的置换方式，都包含在本专利技术的本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种3D乳腺癌细胞的体外快速培养方法，其特征在于，包括如下步骤：(1)复苏MCF
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7贴壁细胞：将液氮储存的MCF
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7细胞经解冻后加入完全培养基混匀，得到细胞混悬液，然后将细胞混悬液转移到培养皿中，放入二氧化碳培养箱培养；(2)消化贴壁细胞：将步骤(1)培养后的细胞用PBS溶液清洗，然后加入消化液消化，使细胞脱落后加入完全培养基离心，去上清液，再加入3D培养基，所得细胞混悬液转移到超低吸附细胞培养板上，放入二氧化碳培养箱培养；(3)3D细胞培养：每天观察细胞状态，每1～2天更换1/2的3D培养基，培养至显微镜下观察到形成大小均一，细胞间间隔不明显，紧密的MCF
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7细胞球，确认3D乳腺癌细胞的体外培养成功。2.根据权利要求1所述的一种3D乳腺癌细胞的体外快速培养方法，其特征在于，步骤(1)中所述解冻程序为：立即放入37℃的水浴中，轻轻旋转小于1分钟快速解冻细胞。3.根据权利要求2所述的一种3D乳腺癌细胞的体外快速培养方法，其特征在于，步骤(1)中所述加入完全培养基混匀前，先加入适量预热的完全培养基，吹打悬匀，以800r/min离心5～10分钟，去上清液。4.根据权利要求3所述的一种3D乳腺...

【专利技术属性】
技术研发人员：焦春伟，谢意珍，梁慧嘉，陈家明，邓初夏，
申请(专利权)人：广东粤微食用菌技术有限公司，
类型：发明
国别省市：