一种用于MPL基因突变检测的特异性探针及检测方法技术

本发明专利技术涉及生物技术领域，特别涉及一种用于MPL基因突变检测的特异性探针及检测方法，探针，由包含两个片段的核苷酸链组成；第一片段，其全部或者一部分具有用于对靶核酸进行分子识别的识别序列；第二片段，包括但不限于C3 Spacer、C6 Spacer、C12 Spacer、Spacer 9或Spacer 18。与现有技术相比，本发明专利技术提供的种用于MPL基因突变检测的特异性探针及检测方法，通过设计特异性结合野生型基因序列的探针，抑制野生型序列的扩增，从而实现了对突变型序列的选择性扩增和富集，可以将Sanger测序法的测序灵敏度由目前的10

【技术实现步骤摘要】
一种用于MPL基因突变检测的特异性探针及检测方法


[0001]本专利技术涉及生物
，特别涉及一种用于MPL基因突变检测的特异性探针及检测方法。

技术介绍

[0002]骨髓增殖性肿瘤是一组异质性的、来源于克隆性造血干细胞的恶性肿瘤，以骨髓一系或多系过度增殖为特征，其中BCR
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ABL1基因阴性的MPN包括真性红细胞增多症(PV)、原发性血小板增多症(ET)和原发性骨髓纤维化(PMF)等。MPL是一种非受体型酪氨酸激酶、JAKs蛋白(Janus kinases)家族成员之一，它通过JAK
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STAT信号通路介导细胞因子的胞内信号转导，在造血干细胞的增殖和分化中起了重要的作用。研究表明，MPL基因V617F激活突变存在于约97％的PV患者、50
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60％的ET患者和50％的PMF患者中。2017年WHO造血和淋巴组织肿瘤分类(第4版)明确将MPL基因V617F突变作为MPN中的PV、ET和PMF的主要诊断指标之一，美国NCCN诊疗指南和中国专家指南均建议采用此标准。
[0003]以Sanger核酸测序法为代表的一代测序测序技术已广泛应用于临床，在多种疾病的预防、诊断及鉴别诊断、预后预测、用药指导、疗效评价等方面都发挥着重要的作用。一代测序技术稳定、简便、自动化程度高、所得数据为直接基因组序列、数据准确、可重复性好，现被公认为基因检测的“金标准”。
[0004]Sanger法又称作双脱氧链终止法，是目前应用最多的核酸测序技术，由Sanger等人于1977年专利技术提出。目前国内外已经开发上市了多款基因分析仪。此类基因分析仪基于大小不同的分子在毛细管电泳中的迁移率不同的原理，当标记有荧光的分子逐一通过毛细管时，激光检测器即可对其逐个进行检测，并同步成像，随后分析软件自动将不同的荧光信号转变为核酸序列，从而实现测序目的。但是传统的Sanger测序法的灵敏度只有20％左右，这极大的限制了其在临床实践中的应用。

技术实现思路

[0005]针对以上述
技术介绍
的不足，本专利技术提供一种用于MPL基因突变检测的特异性探针及检测方法，解决了传统的Sanger测序法的灵敏度不高，基因突变的检出率低的问题。
[0006]一方面，本专利技术提供一种用于MPL基因突变检测的特异性探针，关键在于：由包含两个片段的核苷酸链组成；
[0007]第一片段，其全部或者一部分具有用于对靶核酸进行分子识别的识别序列；
[0008]第二片段，包括但不限于C3 Spacer、C6 Spacer、C12 Spacer、Spacer 9或Spacer18。
[0009]所述第一片段的序列为
[0010]Seq ID NO.1：TGCAGGAAACTGCCACCTCAGCAGCAGCAG。
[0011]优选的，所述第一片段和第二片段通过3
‑3’
结合。
[0012]另一方面，本专利技术提供一种MPL基因突变的检测方法，关键在于包括以下步骤：
[0013]S1.体系配置：将提取血液样本中的基因组为模板、PCR扩增预混液、权利要求1所述的特异性探针、MPL上游引物、MPL下游引物，配置成扩增体系；
[0014]S2.进行多重PCR扩增，将扩增产物纯化；
[0015]S3.将纯化产物作为模板，加入M13R测序引物，进行测序反应；
[0016]S4.将测序产物中依次加入醋酸钠
‑
乙醇混合物、70％乙醇进行纯化；
[0017]S5.将纯化的测序产物进行测序分析。
[0018]优选的，MPL上游引物的序列如下：
[0019]Seq ID NO.2：CAGGAAACAGCTATGACCGGCCGAAGTCTGACCCTTTT；
[0020]MPL下游引物的序列如下：
[0021]Seq ID NO.3：GTACCTGTAGTGTGCAGGAAACT；
[0022]M13R测序引物的序列如下：
[0023]Seq ID NO.4：CAGGAAACAGCTATGACC。
[0024]优选的，S1中的PCR扩增预混液包括Taq DNA聚合酶和荧光染料。
[0025]优选的，S2的扩增程序为：95℃/10min；95℃/15s，60℃/20s，72℃/30s，40个循环；72℃/5min。
[0026]优选的，S2的纯化条件具体为：取6.0μL的PCR扩增产物、1.0μL的核酸外切酶ExoI、0.2μL的小牛肠碱性磷酸酶和2.8μL的纯化水，进行PCR扩增产物的酶解纯化反应；纯化程序为：37℃/60min；80℃/15min；25℃/1min。
[0027]优选的，S3的测序反应程序为：37℃/10min；96℃/1min；96℃/10s，50℃/5s，60℃/2min，35个循环；60℃/2min；25℃/1min。
[0028]优选的，S4的纯化条件具体为：将测序产物中加入16μL醋酸钠
‑
乙醇混合物，涡旋振荡后避光静置，于4℃下离心分离，弃上层液体后加入70μL预冷的70％乙醇，涡旋振荡后，于4℃离心分离，弃上层液体，加入甲酰胺溶解DNA。
[0029]有益效果：与现有技术相比，本专利技术提供的种用于MPL基因突变检测的特异性探针及检测方法，通过设计特异性结合野生型基因序列的探针，抑制野生型序列的扩增，从而实现了对突变型序列的选择性扩增和富集，可以将Sanger测序法的测序灵敏度由目前的10
‑
20％左右提升为0.5％～1％左右，提高了MPL基因突变的检出率。
附图说明
[0030]图1为本专利技术与普通Sanger测序法检测结果对比图。
具体实施方式
[0031]为使本领域技术人员更好的理解本专利技术的技术方案，下面结合附图和具体实施方式对本专利技术作详细说明。
[0032]实施例1一种用于MPL基因突变检测的特异性探针
[0033]探针序列如下：
[0034]TGCAGGAAACTGCCACCTCAGCAGCAGCAG
‑
C3 Spacer。
[0035]实施例2一种用于MPL基因突变检测的特异性探针
[0036]探针序列如下：
[0037]TGCAGGAAACTGCCACCTCAGCAGCAGCAG
‑
C6 Spacer。
[0038]实施例3一种用于MPL基因突变检测的特异性探针
[0039]探针序列如下：
[0040]TGCAGGAAACTGCCACCTCAGCAGCAGCAG
‑
C12 Spacer。
[0041]实施例4一种用于MPL基因突变检测的特异性探针
[0042]探针序列如下：
[0043]TGCAGGAAACTGCCACCTCAGCAGCAGCAG
‑
Spacer 9。
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【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种用于MPL基因突变检测的特异性探针，其特征在于：由包含两个片段的核苷酸链组成；第一片段，其全部或者一部分具有用于对靶核酸进行分子识别的识别序列；第二片段，包括但不限于C3 Spacer、C6 Spacer、C12 Spacer、Spacer 9或Spacer 18；所述第一片段的序列为Seq ID NO.1：TGCAGGAAACTGCCACCTCAGCAGCAGCAG。2.根据权利要求1所述的一种用于MPL基因突变检测的特异性探针，其特征在于：所述第一片段和第二片段通过3
‑3’
结合。3.一种MPL基因突变的检测方法，其特征在于包括以下步骤：S1.体系配置：将提取血液样本中的基因组为模板、PCR扩增预混液、权利要求1所述的特异性探针、MPL上游引物、MPL下游引物，配置成扩增体系；S2.进行多重PCR扩增，将扩增产物纯化；S3.将纯化产物作为模板，加入M13R测序引物，进行测序反应；S4.将测序产物纯化后进行测序分析。4.根据权利要求5所述的一种MPL基因突变的检测方法，其特征在于MPL上游引物的序列如下：Seq ID NO.2：CAGGAAACAGCTATGACCGGCCGAAGTCTGACCCTTTT；MPL下游引物的序列如下：Seq ID NO.3：GTACCTGTAGTGTGCAGGAAACT；M13R测序引物的序列如下：Seq ID NO.4：CAGGAAAC...

【专利技术属性】
技术研发人员：刘金超，王天阳，牛孝亮，段小红，
申请(专利权)人：求臻医学科技北京有限公司，
类型：发明
国别省市：