新型CRISPR-Cas9抑制蛋白及其改造应用于化学可控的基因编辑的方法技术

本发明专利技术公开了新型CRISPR

【技术实现步骤摘要】
新型CRISPR
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Cas9抑制蛋白及其改造应用于化学可控的基因编辑的方法


[0001]本专利技术属于生物
，具体涉及新型CRISPR
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Cas9抑制蛋白及其改造应用于化学可控的基因编辑的方法。

技术介绍

[0002]成簇的规律间隔的短回文重复序列(Clustered regularly interspaced short palindromic repeats，CRISPR)及其CRISPR相关蛋白(CRISPR
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associated，Cas)构成了原核生物适应性免疫防御系统，以防御包括噬菌体和质粒在内的侵入性遗传元件。CRISPR
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Cas介导的防御过程可分为三个阶段：(1)适应阶段：当噬菌体入侵时，噬菌体的一部分序列信息作为新的间隔子插入到细菌的CRISPR基因座，形成免疫记忆；(2)表达阶段：系统表达Cas基因以及加工形成成熟的CRISPRRNA(crRNA)；(3)干扰阶段：Cas蛋白在crRNA的引导下识别并破坏靶向核酸，形成免疫防御。目前基于系统发生树以及作用机制，CRISPR
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Cas系统分为2大类(Class 1和Class 2)，6种类型。Class 1系统(包括I、III和IV型)使用多亚基Cas蛋白复合物靶向外源核酸；而Class 2系统(包括II、V和VI型)则依靠单一效应蛋白(如Cas9)来实现干扰，因而应用广泛。截止目前，Class 2CRISPR
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Cas系统的多种亚型被鉴定并开发为多种强有力的基因编辑工具，主要包括CRISPR
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Cas9、Cas12a(Cpf1)、Cas13a(C2c2)等。它们在科学研究、农业、畜牧业以及临床检测治疗等领域发挥着日益重要的作用。其中来自化脓链球菌(Streptococcuspyogenes)的Cas9(SpyCas9)是应用最为广泛的Cas效应物，并且已被发展成为一系列强有力的基因编辑工具。
[0003]然而，尽管近些年CRISPR基因编辑技术得到了长足发展，它仍面临着尚未解决的脱靶问题，使CRISPR基因编辑技术的应用受到了阻碍。为了解决这一问题，有些研究通过改造Cas蛋白或者向导RNA以提升靶向识别的特异性，或者通过可控的Cas蛋白或者导向RNA丰度与时间的表达来进一步降低脱靶效应。近年来，在原噬菌体或噬菌体中发现了一系列被称为anti
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CRISPR(Acr)的蛋白，它们可以抑制多种CRISPR
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Cas系统的活性，并且一些Acr蛋白(如AcrIIA4)被证明在细胞中可以通过抑制Cas9活性来降低脱靶效应。这些特性使得Acr可作为潜在的“开关”工具用于调控基于CRISPR的应用，因此Acr的探索及其分子机制研究对于基因编辑领域有着十分重要的意义。
[0004]Acr蛋白是噬菌体为了对抗原核生物CRISPR
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Cas系统进化出来的一种策略，即通过编码蛋白质(即Acr蛋白)来失活原核生物的CRISPR
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Cas系统。研究发现Acr蛋白广泛分布于噬菌体、原噬菌体以及侵入性遗传元件中，它们的分子量一般较小，约50
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200氨基酸，并且展现出高度的序列多样性。迄今为止，88种不同类型的Acr蛋白家族已被鉴定出来，能够广泛抑制I、II、III、V和VI型CRISPR
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Cas系统。由于Acr蛋白种类繁多，并展现出高度的序列多样性，因此很难通过常规的序列同源性比对方法来进行寻找。科学家已经利用多种生物信息以及生物化学等方法来寻找并确认Acr蛋白，包括基于Guilt
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by
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association、Self
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targeting、Machine
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learning的生物信息学方法，以及通过Phage
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first和High
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throughput的生物化学方法。值得注意的是，已经通过多种方法发现了23种AcrIIA家族。目前，只有一小部分AcrIIA蛋白的分子机制被详细地阐明。研究显示这些AcrIIA蛋白主要抑制CRISPR
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Cas9免疫的第三个阶段——干扰阶段，并可粗略地分为三种策略：(1)干扰Cas与crRNA的装载，如AcrIIA15；(2)阻止Cas效应复合物与靶向核酸的结合，如AcrIIA4；(3)阻止Cas对靶向核酸的切割，如AcrIIA14。鉴于Acr蛋白能够通过不同的策略抑制CRISPR
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Cas9系统，并以此开发相应的基因编辑调控工具，Acr分子机制的研究已成为基因编辑领域的研究热点。
[0005]目前这些CRISPR
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Cas系统的部分Acr蛋白被鉴定出来，科学家们认为仍有广泛的Acr蛋白应存在并且未被发现。这不仅阻碍我们理解噬菌体与宿主之间的进化竞争方式，也妨碍发展新型的基于Acr的基因编辑方法。特别是考虑到Cas9的脱靶效应，发展Acr蛋白作为有效的基因编辑工具来调控Cas9的活性以解决Cas9应用的安全性问题将特别吸引人。然而在基因编辑领域，可用的Acr蛋白和利用Acr来调控Cas9活性的策略仍然有限。因此发现新型的CRISPR
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Cas9抑制蛋白并改造Acr蛋白应用于可控的基因编辑的方法对于基因编辑领域有着重要的意义。

技术实现思路

[0006]本专利技术的目的在于发现新的CRISPR
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Cas9抑制蛋白，并据此建立可控的基因编辑的方法。
[0007]本专利技术首先保护AcrIIA蛋白在细菌、细胞或真核生物中抑制Cas9基因编辑、调控和/或成像中的应用；
[0008]所述AcrIIA蛋白可为AcrIIA24蛋白、AcrIIA25蛋白、AcrIIA25.1蛋白、AcrIIA26蛋白、AcrIIA27蛋白、AcrIIA28蛋白、AcrIIA29蛋白、AcrIIA30蛋白、AcrIIA31蛋白、AcrIIA31.1蛋白、AcrIIA32蛋白或AcrIIA32.1；
[0009]所述AcrIIA24蛋白可为如下a1)或a2)或a3)或a4)：
[0010]a1)氨基酸序列是SEQ ID NO:1所示的蛋白质；
[0011]a2)在SEQ ID NO:1所示的蛋白质的N端或/和C端连接标签得到的融合蛋白质；
[0012]a3)将a1)或a2)所示的蛋白质经过一个或几个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加得到的且具有抑制Cas9蛋白活性功能的蛋白质；
[0013]a4)与SEQ ID NO:1限定的氨基酸序列具有60％或60％以上同源性，且具有抑制Cas9蛋白活性功能的蛋白质；
[0014]所述AcrIIA25蛋白可为如下b1)或b2)或b3)或b4)：
[0015]b1)氨基酸序列是SEQ ID NO:2所示的蛋白质；
[0016本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.AcrIIA蛋白在细菌、细胞或真核生物中抑制Cas9基因编辑、调控和/或成像中的应用；所述AcrIIA蛋白为AcrIIA24蛋白、AcrIIA25蛋白、AcrIIA25.1蛋白、AcrIIA26蛋白、AcrIIA27蛋白、AcrIIA28蛋白、AcrIIA29蛋白、AcrIIA30蛋白、AcrIIA31蛋白、AcrIIA31.1蛋白、AcrIIA32蛋白或AcrIIA32.1；所述AcrIIA24蛋白为如下a1)或a2)或a3)或a4)：a1)氨基酸序列是SEQ ID NO:1所示的蛋白质；a2)在SEQ ID NO:1所示的蛋白质的N端或/和C端连接标签得到的融合蛋白质；a3)将a1)或a2)所示的蛋白质经过一个或几个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加得到的且具有抑制Cas9蛋白活性功能的蛋白质；a4)与SEQ ID NO:1限定的氨基酸序列具有60％或60％以上同源性，且具有抑制Cas9蛋白活性功能的蛋白质；所述AcrIIA25蛋白为如下b1)或b2)或b3)或b4)：b1)氨基酸序列是SEQ ID NO:2所示的蛋白质；b2)在SEQ ID NO:2所示的蛋白质的N端或/和C端连接标签得到的融合蛋白质；b3)将b1)或b2)所示的蛋白质经过一个或几个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加得到的且具有抑制Cas9蛋白活性功能的蛋白质；b4)与SEQ ID NO:2限定的氨基酸序列具有60％或60％以上同源性，且具有抑制Cas9蛋白活性功能的蛋白质；所述AcrIIA25.1蛋白为如下c1)或c2)或c3)或c4)：c1)氨基酸序列是SEQ ID NO:3所示的蛋白质；c2)在SEQ ID NO:3所示的蛋白质的N端或/和C端连接标签得到的融合蛋白质；c3)将c1)或c2)所示的蛋白质经过一个或几个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加得到的且具有抑制Cas9蛋白活性功能的蛋白质；c4)与SEQ ID NO:3限定的氨基酸序列具有60％或60％以上同源性，且具有抑制Cas9蛋白活性功能的蛋白质；所述AcrIIA26蛋白为如下d1)或d2)或d3)或d4)：d1)氨基酸序列是SEQ ID NO:4所示的蛋白质；d2)在SEQ ID NO:4所示的蛋白质的N端或/和C端连接标签得到的融合蛋白质；d3)将d1)或d2)所示的蛋白质经过一个或几个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加得到的且具有抑制Cas9蛋白活性功能的蛋白质；d4)与SEQ ID NO:4限定的氨基酸序列具有60％或60％以上同源性，且具有抑制Cas9蛋白活性功能的蛋白质；所述AcrIIA27蛋白为如下e1)或e2)或e3)或e4)：e1)氨基酸序列是SEQ ID NO:5所示的蛋白质；e2)在SEQ ID NO:5所示的蛋白质的N端或/和C端连接标签得到的融合蛋白质；e3)将e1)或e2)所示的蛋白质经过一个或几个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加得到的且具有抑制Cas9蛋白活性功能的蛋白质；e4)与SEQ ID NO:5限定的氨基酸序列具有60％或60％以上同源性，且具有抑制Cas9蛋
白活性功能的蛋白质；所述AcrIIA28蛋白为如下f1)或f2)或f3)或f4)：f1)氨基酸序列是SEQ ID NO:6所示的蛋白质；f2)在SEQ ID NO:6所示的蛋白质的N端或/和C端连接标签得到的融合蛋白质；f3)将f1)或f2)所示的蛋白质经过一个或几个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加得到的且具有抑制Cas9蛋白活性功能的蛋白质；f4)与SEQ ID NO:6限定的氨基酸序列具有60％或60％以上同源性，且具有抑制Cas9蛋白活性功能的蛋白质；所述AcrIIA29蛋白为如下g1)或g2)或g3)或g4)：g1)氨基酸序列是SEQ ID NO:7所示的蛋白质；g2)在SEQ ID NO:7所示的蛋白质的N端或/和C端连接标签得到的融合蛋白质；g3)将g1)或g2)所示的蛋白质经过一个或几个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加得到的且...

【专利技术属性】
技术研发人员：权利要求书三页说明书二二页序列表八页附图一二页，
申请(专利权)人：中国科学院生物物理研究所，
类型：发明
国别省市：