基于臧红T荧光猝灭法测定血清过氧化氢酶活度的方法技术

本发明专利技术涉及过氧化氢酶活度检测领域，具体涉及一种基于臧红T荧光猝灭法测定血清过氧化氢酶活度的方法，该方法基于H2O2/Fe

【技术实现步骤摘要】
基于臧红T荧光猝灭法测定血清过氧化氢酶活度的方法


[0001]本专利技术涉及过氧化氢酶活度检测领域，具体涉及一种基于臧红T荧光猝灭法测定血清过氧化氢酶活度的方法。

技术介绍

[0002]过氧化氢酶(catalase，CAT)广泛存在于人体内，被作为与抗肿瘤，抗衰老有密切关系的酶学指标拉入临床常规检测。在过氧化氢酶活度测定文献报道中有紫外
‑
可见光度法、滴定法等。近年来，显色光度法和褪色光度法备受关注，然而显色剂溶液的保存是一大障碍，随用随配难于满足临床检验要求；褪色光度法的准确度相对不高。荧光检测因其背景信号小、灵敏度及准确度高等优异性能已应用在活度分析。

技术实现思路

[0003]为解决上述问题，本专利技术提供了一种基于臧红T荧光猝灭法测定血清过氧化氢酶活度的方法，操作简便、快速、灵敏度高，可成功用于健康人体血清过氧化氢酶活度分析，有较好的临床应用前景。
[0004]为实现上述目的，本专利技术采取的技术方案为：基于臧红T荧光猝灭法测定血清过氧化氢酶活度的方法，该方法基于H2O2/Fe
2+
作用下的臧红T荧光猝灭体系实现过氧化氢酶活度测定，荧光试剂臧红T于575 nm处有最大发射波长，Fe
2+
催化H2O2氧化臧红T导致其荧光猝灭，过氧化氢酶分解H2O2引起荧光回位，通过过氧化氢酶加入前后荧光猝灭值
△
F获取过氧化氢酶的活度，其中，
△
F=0.7527+1807E(U/mL)，r=0.9980，最低检测限达到3.81
×
10
‑
5 U/mL。
[0005]本专利技术所述的基于臧红T荧光猝灭法测定血清过氧化氢酶活度的方法包括如下步骤：取人体血清25~100 μL置于容量瓶中，加入1.00 mL H2O2底液，恒温30 o
C下反应10 min后，立即加入0.80 mL Fe
2+
、3.00 mL 臧红T，室温反应15 min后定容，臧红T空白作参比，在1 cm吸收池中测定575 nm发射波长处荧光强度F；测定酶空白体系F0，测定时，在H2O2之前加入Fe
2+
完成酶失活，后续方法同前；过氧化氢酶活度E由
△
F确定，其中，
△
F = F
‑ꢀ
F0，
△
F=0.7527+1807E(U/mL)，r=0.9980。
[0006]本专利技术利用过氧化氢酶对H2O2氧化臧红T反应具有抑制作用的原理，提出了测定过氧化氢酶活度的荧光猝灭法。研究结果表明，该方法的灵敏性、准确性及稳定性更具优势，无需繁杂的处理程序，可直接用于人体血清过氧化氢酶活度分析，最低检出量可达到3.81
×
10
‑
5 U/mL，明显优于显色和褪色光度法；荧光值的大小仅取决于猝灭反应程度，与溶液的浊度、色度及组成成分无关；采用显酸性的Fe
2+
作为酶样失活剂(酶促反应终止剂)，将有效克服血清中其余还原性物质的干扰。
附图说明
[0007]图1为臧红T不同体系荧光谱图。
[0008]图2为催化剂催化作用比较。
[0009]图3 为臧红T用量的影响图。
[0010]图4为硫酸用量的影响图；图中：a.臧红T；b.H2O2+臧红T+Fe
2+
。
[0011]图5为底液H2O2用量的影响图。
[0012]图6为酶促反应时间的影响图。
[0013]图7为过氧化氢酶活度工作曲线。
具体实施方式
[0014]为了使本专利技术的目的及优点更加清楚明白，以下结合实施例对本专利技术进行进一步详细说明。应当理解，此处所描述的具体实施例仅仅用以解释本专利技术，并不用于限定本专利技术。
[0015]以下试验用μmol/mL (U/mL)表示酶活度，即1mL酶液所能分解过氧化氢物质的量(μmol)。
[0016]试验资料1.1 试剂与仪器30%的双氧水(分析纯)购自国药集团化学试剂有限公司；过氧化氢酶固体(生物试剂，标示量≥3000 U/mg)购自如吉生物科技发展有限公司；臧红T固体(生物试剂)购自天津市大茂化学试剂厂；FeSO4·
7H2O固体(分析纯)购自福晨化学试剂有限公司；930N荧光分光光度计购自上海精密科学仪器有限公司。
[0017]溶液配制H2O2底液：将0.50 mL 30%的双氧水稀释成250 mL，高锰酸钾法测定其浓度，根据测定值二次稀释为1 mmol/L (即1 μmol/mL)；过氧化氢酶标准溶液：1 U/mL。称过氧化氢酶固体5 mg，蒸馏水定容至100 mL，高锰酸钾法测定其活度(E=100 U/mL)，根据测定结果二次稀释为1 U/mL；2 mmol/L 臧红T：称0.7016 g臧红T固体，蒸馏水定容至1000 mL；0.01 mol/L Fe
2+
：称0.6950 g FeSO4·
7H2O固体，配制成250 mL溶液。
[0018]过氧化氢酶活度测定方法取人体血清25~100 μL置于容量瓶(50 mL)中，加1.00 mL H2O2底液，恒温30 o
C下反应10 min后立即加入0.80 mL Fe
2+
、3.00 mL 臧红T，室温反应15 min后定容，臧红T空白作参比，在1 cm吸收池中测定575 nm发射波长处荧光强度F。同步测定酶空白体系F0(在H2O2之前加入Fe
2+
完成酶失活，后续方法同前)，过氧化氢酶活度E由
△
F (
△
F = F
‑ꢀ
F0)确定。
[0019]荧光猝灭反应条件优化1.4.1 荧光猝灭反应催化剂的选择取50 mL容量瓶4只，1号瓶中加入臧红T；2号瓶中加入臧红T、H2O2；3号瓶中加入臧红T、H2O2和Fe
3+
；4号瓶中加入臧红T、H2O2和Fe
2+
。蒸馏水定容，室温反应15 min后定容，按1.3项方法测定F。
[0020]臧红T用量的选择
在50 mL容量瓶中加入不同体积(1
‑
7 mL)臧红T，蒸馏水定容后，按1.3项方法测定F。
[0021]荧光猝灭反应溶液pH考察按1.3项方法完成荧光猝灭反应，与此同时加入不同体积硫酸(0
‑
1 mL)，蒸馏水定容后，测定F。
[0022]荧光猝灭反应时间考察在50 mL容量瓶依次加入H2O2、臧红T和Fe
2+
，改变混合反应时间，蒸馏水定容后，按1.3项方法测定F。
[0023]1.4.5 荧光猝灭反应催化剂Fe
2+
用量选择在50 mL容量瓶依次加入H2O2、臧红T，再加入不同体积Fe
2+ (0.00~1.20 mL)，蒸馏水定容，按1.3项方法测定F。
[0024]1.5 酶本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.基于臧红T荧光猝灭法测定血清过氧化氢酶活度的方法，其特征在于，该方法基于H2O2/Fe
2+
作用下的臧红T荧光猝灭体系实现过氧化氢酶活度测定，荧光试剂臧红T于575 nm处有最大发射波长，Fe
2+
催化H2O2氧化臧红T导致其荧光猝灭，过氧化氢酶分解H2O2引起荧光回位，通过过氧化氢酶加入前后荧光猝灭值
△
F获取过氧化氢酶的活度，其中，
△
F=0.7527+1807E(U/mL)，r=0.9980，最低检测限达到3.81
×
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‑
5 U/mL。2.如权利要求1所述的基于臧红T荧光猝灭法测定血清过氧化氢酶活度的方法，其特征在于，包括如下步骤：取人体血清25~100 μL置于容量瓶中，加入1.00 mL ...

【专利技术属性】
技术研发人员：张爱菊，董娜，白莹，张小林，
申请(专利权)人：甘肃医学院，
类型：发明
国别省市：