一种基于nMALDI-TOF技术的多SNP位点基因分型方法技术

本发明专利技术属于SNP位点基因分型技术领域，具体涉及一种基于nMALDI

【技术实现步骤摘要】
一种基于nMALDI
‑
TOF技术的多SNP位点基因分型方法


[0001]本专利技术属于SNP位点基因分型
，具体涉及一种基于nMALDI
‑
TOF技术的多SNP位点基因分型方法。

技术介绍

[0002]核酸质谱检测技术是在MALDI
‑
TOF原理的基础上，结合引物延伸分析法和碱基特异裂解分析法，针对双链DNA的特性进行特殊优化，使样品在电离过程中不产生或产生较少的碎片离子，可检测生物样品中的核酸分子量，是研究基因组单核苷酸多态性(single nucleotide polymorphism,SNP)的重要手段，这一技术近年来被广泛应用在精准医疗检测项目中。核酸质谱检测分四个步骤完成：
①
样本的DNA提取及DNA质检；
②
基因位点选择及引物设计、合成与质检；
③
样品DNA的3步反应(PCR扩增、SAP反应纯化及单碱基延伸反应)；
④
反应产物上样至专用芯片用MALDI
‑
TOF
‑
MS检测，得到检测结果。用飞行时间质谱技术检测核酸，实验结果稳定，与以凝胶电泳为基础的测序法相比，具有分辨率高、分离速度快、杂质干扰少的优点。质谱技术在基因分型方面的应用有大量文献做深入分析，基因分型检测被广范应用于疾病诊断，是基因分型分析的利器。
[0003]应用该技术进行基因分型的常规方案在进行PCR扩增、SAP反应纯化及单碱基延伸反应，所用操作时间超7.3h，无法当天出检测结果。

技术实现思路

[0004]为解决上述技术问题，缩短基因分型的操作时间，本专利技术提供了一种基于nMALDI
‑
TOF技术的多SNP位点基因分型方法。
[0005]本专利技术采用如下技术方案：
[0006]一种基于nMALDI
‑
TOF技术的多SNP位点基因分型方法，包括如下步骤：
[0007]S1、针对待测样本DNA的多个SNP位点设计并合成探针以及PCR扩增引物，所述探针为拱桥式探针，包括两端的探针结合区和中间的探针臂，所述探针臂为非人类序列；
[0008]S2、将探针和样本DNA进行杂交；
[0009]S3、在S2的杂交反应产物中加入延伸连接反应液，混匀，然后进行延伸、连接；
[0010]S4、在S3的反应产物中加入核酸外切酶
Ⅶ
，混匀，进行酶切；
[0011]S5、在S4的反应产物中加入S5&N7引物的混合液、纯化水、PCR预混液，混匀，进行PCR反应；
[0012]S6、将S5的反应产物脱盐后，上样至专用芯片用MALDI
‑
TOF
‑
MS检测，得到检测结果。
[0013]进一步的，所述探针臂序列为TAGATCGCTAAGGCGA。
[0014]进一步的，所述S5&N7引物序列如下：
[0015]S5引物：5'
‑
TAGATCGC
‑
3'；
[0016]N7引物：5'
‑
TAAGGCGA
‑
3'。
[0017]进一步的，S2的杂交反应体系为：X ul的样本DNA，1ul的探针MIX，1ul的杂交缓冲液，纯化水补足10ul，X表示10～50ng DNA样本体积。
[0018]更进一步的，S2的杂交反应程序为：98℃，5min；60℃，1.5h；4℃，保持。
[0019]更进一步的，S3中延伸连接反应液的加入量为1ul，延伸、连接的程序均为：60℃，10min；4℃，保持。
[0020]更进一步的，S4的外切酶混合液加入量为1ul，酶切的反应程序为：37℃，30min；95℃，10min；4℃，保持。
[0021]更进一步的，S5中加入S5&N7引物的混合液、纯化水、PCR预混液的量依次为25ul、8.5ul、3ul，PCR反应程序为：98℃，30s；98℃，10s，61℃，30s，72℃，20s，20个循环；72℃，5min；4℃，保持。
[0022]本专利技术的有益效果如下：
[0023]本专利技术应用分子探针及滚环扩增技术将原来的实验时间缩短了一半，可实现当天完成检测；并且应用分子探针技术可克服因为多重PCR的引物非特异性结合问题，实现更多基因位点检测。
附图说明
[0024]图1为拱桥式探针模式图。
[0025]图2为采用对比例1方法(A)和实施例1方法(B)对rs2306283位点的检测结果。
[0026]图3为采用对比例1方法(A)和实施例1方法(B)对rs4149056位点的检测结果。
[0027]图4为采用对比例1方法(A)和实施例1方法(B)对rs7412位点的检测结果。
[0028]图5为采用对比例1方法(A)和实施例1方法(B)对rs429358位点的检测结果。
具体实施方式
[0029]下面结合附图和具体实施例对本专利技术进行详细说明，但不应理解为本专利技术的限制。如未特殊说明，下述实施例中所用的技术手段为本领域技术人员所熟知的常规手段，下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。
[0030]应用核酸飞行时间质谱技术(nMALDI
‑
TOF)进行基因分型的原理：
[0031]质谱仪的质量分析器是离子漂移管。由离子源产生的离子加速后进入无场漂移管，并以恒定速度飞向离子接收器。离子质量越大，到达接收器所用时间越长，离子质量越小，到达接收器所用时间越短，根据这一原理，可以把不同质量的离子按m/z值大小进行分离。该技术的实现依托与多重PCR反应、单碱基延伸反应及碱基之间的质量差，因为技术弊端，受多重PCR的影响，该方法无法将同源性高的序列放到一起反应，故限制了其单管反应检测位点数。优化的方案完成抛开现有的操作流程，采用分子探针技术与待检测样本杂交，改造探针样式，从传统的线性探针，改造成拱桥式探针，所有的探针臂上采用非人类序列连接，此改造可在空间上控制探针与样本的杂交，减少非特异性结合，因为所有的探针臂都是相同序列，运用滚环扩增即可将序列数量扩增出来，达到可检测浓度。探针样式如图1所示。
[0032]实施例1：基于nMALDI
‑
TOF技术的多SNP位点基因分型方法
[0033]1、杂交反应
[0034]1.1取出冰盒、待测样本DNA、探针MIX、杂交缓冲液，室温解冻，待解冻后涡旋混匀，
瞬时离心，置于冰盒上待用。准备相应数量的PCR管并做好标记。
[0035]1.2按照下表在200ul PCR管中配制杂交反应体系(10ul)：
[0036]表1杂交反应体系
[0037][0038]注：当样本为外周血时，“X”表示10～50ng DNA样本体积，推荐50ng。
...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种基于nMALDI
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TOF技术的多SNP位点基因分型方法，其特征在于，包括如下步骤：S1、针对待测样本DNA的多个SNP位点设计并合成探针以及PCR扩增引物，所述探针为拱桥式探针，包括两端的探针结合区和中间的探针臂，所述探针臂为非人类序列；S2、将探针和样本DNA进行杂交；S3、在S2的杂交反应产物中加入延伸连接反应液，混匀，进行延伸、连接；S4、在S3的反应产物中加入核酸外切酶
Ⅶ
，混匀，进行酶切；S5、在S4的反应产物中加入S5&N7引物的混合液、纯化水、PCR预混液，混匀，进行PCR反应；S6、将S5的反应产物脱盐后，上样至MALDI
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TOF
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MS检测，得到检测结果。2.根据权利要求1所述的一种基于nMALDI
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TOF技术的多SNP位点基因分型方法，其特征在于，所述探针臂序列为TAGATCGCTAAGGCGA。3.根据权利要求2所述的一种基于nMALDI
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TOF技术的多SNP位点基因分型方法，其特征在于，所述引物序列如下：S5引物：5'
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TAGATCGC
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3'；N7引物：5'
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TAAGGCGA
‑
3'。4.根据权利要求3所述的一种基于nMALD...

【专利技术属性】
技术研发人员：李赟，刘文兰，
申请(专利权)人：深圳市第二人民医院深圳市转化医学研究院，
类型：发明
国别省市：