一种棕色脂肪细胞来源的外泌体及其制备方法和应用技术

本发明专利技术公开一种棕色脂肪细胞来源的外泌体及其制备方法和应用，属于分子生物学技术领域。本发明专利技术提供的外泌体的制备方法包括构建共表达PPARγ和CEBPβ的人源皮肤成纤维细胞，得到棕色脂肪前体细胞；利用棕色脂肪细胞诱导分化培养基对棕色脂肪前体细胞进行诱导分化培养，获得棕色脂肪细胞；使棕色脂肪细胞分泌外泌体，获得棕色脂肪细胞来源的外泌体。本发明专利技术提供的外泌体可以通过外敷给药方式治疗关节炎疼痛症状，因此可用于制备治疗关节炎相关病症的药物。症的药物。症的药物。

【技术实现步骤摘要】
一种棕色脂肪细胞来源的外泌体及其制备方法和应用


[0001]本专利技术属于分子生物学
，具体涉及一种人源皮肤成纤维细胞（HEF细胞）转分化的棕色脂肪细胞来源的外泌体及其制备方法和应用。

技术介绍

[0002]关节炎症状包括一处或多处关节出现炎症，主要症状为关节疼痛、僵硬、活动受限，关节皮肤发热发红，肌无力和肌萎缩等，其病因尚未完全清楚，但已知与多因素有关，包括先天遗传因素、后天环境因素、年龄、性别、肥胖、关节损伤、关节过度使用等。
[0003]根据最新的流行病学研究表明，我国至少有关节炎患者约6千万人，而且患病人数逐渐增加。关节炎不仅影响患者的生活质量，如此大的患病基数也对社会以及国民生产造成了极大的负担。目前，针对关节炎的治疗方案都存在一定的毒副作用或者创伤式损伤缺陷。因此，如何通过无创和安全的方式让关节炎患者受益，是目前关注的重点。
[0004]随着干细胞研究的深入以及生物工程技术的普遍应用，越来越多的研究者探索这一技术在关节炎治疗领域中的应用，逐渐展现了较为乐观的应用前景。然而，现有干细胞治疗关节炎的方式多为病患处原位注射干细胞，但注射方式为有创治疗，其必然会存在一定的风险，包括局部出血、血肿等，尤其当无菌操作不当时，可能会造成局部感染。另外，若注射不当，还可能会造成局部组织栓塞，导致局部组织坏死等。

技术实现思路

[0005]针对现有技术中存在的一个或多个问题，本专利技术一个方面提供一种棕色脂肪细胞来源的外泌体的制备方法，其包括以下步骤：S1：构建共表达PPARγ和CEBPβ的人源皮肤成纤维细胞，得到棕色脂肪前体细胞；S2：利用棕色脂肪细胞诱导分化培养基对步骤S1获得的棕色脂肪前体细胞进行诱导分化培养，获得棕色脂肪细胞；S3：使步骤S2获得的棕色脂肪细胞分泌外泌体，获得棕色脂肪细胞来源的外泌体。
[0006]在一些实施方式中，步骤S1中所述构建共表达PPARγ和CEBPβ的人源皮肤成纤维细胞的操作为：S11：分别构建表达PPARγ和CEBPβ的慢病毒表达载体，得到PPARγ慢病毒表达载体和CEBPβ慢病毒表达载体；S12：分别对步骤S11构建获得的PPARγ慢病毒表达载体和CEBPβ慢病毒表达载体进行慢病毒包装，得到表达PPARγ的慢病毒和表达CEBPβ的慢病毒；S13：使用步骤S12获得的表达PPARγ的慢病毒和表达CEBPβ的慢病毒对人源皮肤成纤维细胞进行慢病毒感染，得到所述棕色脂肪前体细胞。
[0007]在一些实施方式中，步骤S1中所述PPARγ和CEBPβ的编码序列分别如SEQ ID NO:1和SEQ ID NO:2所示。
[0008]在一些实施方式中，步骤S2中所述棕色脂肪细胞诱导分化培养基的配方包括：体
积百分含量为97%
‑
99%的高糖DMEM、体积百分含量为1%
‑
3%的胎牛血清、32
‑
34 μM的生物素、0.4
‑
0.6 μM的胰岛素、16
‑
18 μM的泛酸、0.09
‑
0.11 μM的DEX、1
‑
3 μM的T3、0.50
‑
0.60 mM的IBMX和0.02
‑
0.04 mM的吲哚美辛。
[0009]在一些实施方式中，步骤S2中所述诱导分化培养的时间为6天以上。
[0010]在一些实施方式中，步骤S2中所述诱导分化培养的条件为5%CO2，37
±
1℃。
[0011]在一些实施方式中，步骤S3中所述使步骤S2获得的棕色脂肪细胞分泌外泌体的操作为使用无血清基础培养基对所述棕色脂肪细胞进行培养。
[0012]本专利技术另一方面还提供一种人源皮肤成纤维细胞转分化的棕色脂肪细胞来源的外泌体，其由上述的制备方法获得。
[0013]上述的棕色脂肪细胞来源的外泌体在制备用于治疗关节炎相关病症的药物中的应用也属于本专利技术的内容。
[0014]本专利技术再一方面还提供一种治疗关节炎相关病症的药物，其包括上述的棕色脂肪细胞来源的外泌体作为活性成分。
[0015]在一些实施方式中，所述药物为外用药物，其剂型包括散剂、溶液、酊剂、醑剂、洗剂、软膏、乳膏、糊剂、油剂、凝胶剂、涂膜剂、擦剂、滴剂、气雾剂、湿敷剂、栓剂、贴剂和喷剂。
[0016]在一些实施方式中，所述关节炎相关病症包括痛风性关节炎、颈椎间盘突出、腰间盘突出、腰椎间盘病变和腱炎。
[0017]基于以上技术方案提供的人源皮肤成纤维细胞转分化的棕色脂肪细胞来源的外泌体的制备方法可通过使分化终端（已经丧失全能干性）的人源皮肤成纤维细胞共表达PPARγ和CEBPβ，进而获得具有分化为成熟棕色脂肪细胞潜力的棕色脂肪前体细胞，利用棕色脂肪细胞诱导分化培养基诱导培养该棕色脂肪前体细胞，可以获得能够分泌外泌体的棕色脂肪细胞。实施例结果表明，本专利技术提供的人源皮肤成纤维细胞转分化的棕色脂肪细胞来源的外泌体可以通过外敷给药方式治疗关节炎相关病症，并具有无创改善关节炎疼痛症状的优异效果，能够显著缓解患者疼痛，且不存在副作用或副作用小，因此该外泌体可以应用于制备治疗和改善包括痛风性关节炎、颈椎间盘突出、腰间盘突出、腰椎间盘病变和腱炎在内的关节炎相关病症的药物。
附图说明
[0018]图1为稳定表达GFP的HEF细胞，单稳定表达的CEBPβ的HEF细胞作以及稳定共表达PPARγ和CEBPβ的HEF细胞经棕色脂肪细胞诱导分化培养基诱导培养后的细胞形态。
具体实施方式
[0019]针对现有技术中存在的关节炎治疗方式的诸多缺陷，本专利技术提供一种人源皮肤成纤维细胞转分化的棕色脂肪细胞来源的外泌体，可通过向关节炎相关病症疼痛处外敷该外泌体的方法治疗关节炎相关病症，并提供了该外泌体的制备方法。
[0020]本专利技术人惊讶发现，虽然HEF细胞是一种分化终端的细胞，已经丧失了全能干性，但当将其改造成稳定共表达PPARγ和CEBPβ的细胞时，能够使其具有分化为棕色脂肪细胞的潜力，并且本专利技术人还发现利用由该人源皮肤成纤维细胞转分化的棕色脂肪细胞分泌的外泌体能够治疗关节炎相关病症，并具有良好的治疗效果。基于此，本专利技术提供了人源皮肤
成纤维细胞转分化的棕色脂肪细胞来源的外泌体及其制备方法和在制备治疗关节炎相关病症的药物（尤其是外敷药物）中的应用。
[0021]以下结合具体实施例，对本专利技术进一步阐述。应当理解的是，具体实施例仅用于进一步说明本专利技术，而不是用于限制本专利技术的内容。
[0022]下述实施例中所用方法如无特别说明均为常规方法。具体步骤可参见：《分子克隆实验指南》（《Molecular Cloning: A Laboratory Manual》 Sambrook，J.，Russell， David W.，Molecular Cloning: A Laboratory Manual，3rd edition，2001，NY，Cold Spring Harbor）。
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【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种棕色脂肪细胞来源的外泌体的制备方法，其包括以下步骤：S1：构建共表达PPARγ和CEBPβ的人源皮肤成纤维细胞，得到棕色脂肪前体细胞；S2：利用棕色脂肪细胞诱导分化培养基对步骤S1获得的棕色脂肪前体细胞进行诱导分化培养，获得棕色脂肪细胞；S3：使步骤S2获得的棕色脂肪细胞分泌外泌体，获得棕色脂肪细胞来源的外泌体。2.根据权利要求1所述的制备方法，其中，步骤S1中所述构建共表达PPARγ和CEBPβ的人源皮肤成纤维细胞的操作为：S11：分别构建表达PPARγ和CEBPβ的慢病毒表达载体，得到PPARγ慢病毒表达载体和CEBPβ慢病毒表达载体；S12：分别对步骤S11构建获得的PPARγ慢病毒表达载体和CEBPβ慢病毒表达载体进行慢病毒包装，得到表达PPARγ的慢病毒和表达CEBPβ的慢病毒；S13：使用步骤S12获得的表达PPARγ的慢病毒和表达CEBPβ的慢病毒对人源皮肤成纤维细胞进行慢病毒感染，得到所述棕色脂肪前体细胞。3.根据权利要求1或2所述的制备方法，其中，步骤S1中所述PPARγ和CEBPβ的编码序列分别如SEQ ID NO:1和SEQ ID NO:2所示。4.根据权利要求1或2所述的制备方法，其中，步骤S2中所述棕色脂肪细胞诱导分化培养基的配方包括：体积百分含量为97%
‑
99%的高糖DMEM、体积百分含量为1%
‑
3%的胎牛血清、32
‑
34 μM的生物素、0.4
‑
0.6...

【专利技术属性】
技术研发人员：金万洙，叶荣财，
申请(专利权)人：中国科学院动物研究所，
类型：发明
国别省市：