一种基于吸附态洛伊希瓦氏菌PV-4实现微生物电化学传感器即时检测的方法技术

以电化学活性微生物(EAB)为核心的微生物电化学传感器(MEB)，可以直接将待测物质信息转导为电信号，具有操作简单、检测迅速、灵敏度高、检测成本低等优势，在生物医学及环境监测领域具有良好的应用前景。即时检测是生物医学及环境监测领域的重要发展方向。然而，传统MEB均使用EAB所形成的成熟生物膜作为传感元件，这导致了冗长和复杂的传感器启动过程，无法满足即时检测的需求。为解决这一问题，本发明专利技术提出了一种基于吸附态洛伊希瓦氏菌(Shewanella loihica)PV

【技术实现步骤摘要】
一种基于吸附态洛伊希瓦氏菌PV
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4实现微生物电化学传感器即时检测的方法


[0001]本专利技术涉及微生物电化学
，具体涉及一种基于吸附态洛伊希瓦氏菌(Shewanella loihica)PV
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4实现微生物电化学传感器即时检测的方法。

技术介绍

[0002]生物传感器具有成本低廉、操作简单、选择性强和检测快速等特点，同时检测结果能够真实地反映样品的生物利用度信息，已广泛地应用于生物医学、食药分析、环境监测等领域。一般而言，生物传感器的检测原理主要包含两个过程，首先是利用生物元器件感应样品中的待测物质，然后将生物元器件与待测物质发生的生物学反应转换为电信号。最早所采用的生物元器件是酶，基于酶的特异性催化作用可以实现对目标物的选择性检测。此后，核酸、适配体、抗体、荧光蛋白等也被应用于生物传感器。然而，这些生物活性分子制备过程依赖极高的分子生物学专业技术，需要过表达、纯化、重构等复杂过程，限制了其实际应用。同时，现有的生物元器件与待测物质的生物学反应主要为产生光信号。例如广泛使用的免疫荧光技术的基本原理是生物元器件与待测物质结合后会产生荧光信号，另一项已产业化的酶联免疫吸附技术则是利用生物元器件与待测物质结合后可催化颜色反应的发生。但将待测物质浓度信息转导为荧光或色度等光信号后还需要借助复杂或昂贵的仪器实现光电转换，极大地增加了生物传感器的使用成本。更重要的是，光信号极易受环境和背景色彩的影响，导致检测结果出现假阴性或者假阳性，这也明显降低了检测结果的准确度和可重复性。
>[0003]微生物电化学传感器(Microbial Electrochemical Sensor，MEB)有望解决这些问题。MEB的核心是电化学活性微生物(Electrochemical Actively Bacteria， EAB)。与其他环境微生物相比，EAB具有独特的胞外电子传递(ExtracellularElectron Transfer，EET)功能，可以将呼吸链产生的电子传递至胞外形成输出电流(正向EET)，或直接消耗输入电流完成能量代谢(反向EET)。因此，当EAB 与待测物质发生生化反应后，可以直接影响EET的电子传递速率，最终表现为输出/输入电流的变化。与其他生物传感器相比，EAB同时包含了生物活性物质和信号转导元件，不需要额外的信号转导过程即可将待测物质信息直接转导为电信号；同时，EAB作为完整的天然细胞，不需要基因工程、蛋白分离、纯化、重构等复杂的分子生物学技术，具有较低的技术门槛和使用成本，被认为是目前最有前景的生物传感器技术。
[0004]MEB技术首次报道于2003年，基于EAB的正向EET过程，韩国科学技术研究院Byung Hong Kim教授团队率先实现了对生物利用度评价指标——生化需氧量的快速检测，将传统检测方法所需要5天的检测时间降低至4小时。该方法的基本原理是EAB可以将有机物中的化学能转化为电能，因此在EAB生物量保持稳定的条件下，输出电流与底物浓度在一定范围内具有良好的线性关系。2007 年，韩国科奥比研究院Mia Kim等人进一步地利用MEB检测了水质生物毒性。与其他水质生物毒性检测技术相比，采用这一技术成功突破了水质生物毒
性实时快速检测的应用瓶颈。该方法的基本原理是利用EAB分解有机物产生的电信号，当水体中出现有毒物质时，EAB的电信号会出现下降，因此通过测量EAB的电信号即可检测水质毒性。与其他水质生物毒性检测技术相比，采用这一技术成功突破了水质生物毒性实时快速检测的应用瓶颈。2020年，我国刘红教授团队创新地采用EAB的正向和反向EET，利用MEB实现了对水体生化需氧量和硝态氮的同步快速检测。此外，MEB还被应用于检测癌症标志物富马酸、肠道微生物重要代谢产物氧化三甲胺等物质。这些方法的基本原理均是利用EAB可以直接吸收电子并还原待测物质，因此通过测量输入电流即可分析待测物质的浓度。与传统生物电化学传感器(例如酶电化学传感器或免疫电化学传感器)相比， MEB可以将电信号强度提升至毫安级别，比传统研究报道的结果高3
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6个数量级，同时MEB检测的灵敏度可达到安/摩尔，也较以往研究提高了10
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100倍。综上，MEB结合全细胞传感器和电化学传感器的特点，仅利用同一生物元器件即可同步实现待测物质识别与生物信号转导，具有高效、快捷、方便、低成本等优势，对生物医学及环境指标的快速检测具有重要意义。
[0005]尽管MEB具有检测成本低、灵敏度高、特异性强及易微型化等优势，但传统MEB均使用了EAB所形成的成熟生物膜作为传感元件，这导致了冗长和复杂的传感器启动过程(通常需要1
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4周)。例如，北京航空航天大学刘红教授团队前期利用MEB检测水质生物毒性毒性的研究中，基于纯培养洛伊希瓦氏菌 (Shewanella loihica)PV
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4的MEB启动时间约为8000分钟(约5.5天)，而基于以Geobacter为优势菌群的混菌MEB启动时间约为12000分钟(约8.3天)。在另一项利用MEB同步检测水体生化需氧量和硝态氮的研究中，能够检测水体生化需氧量(具有正向EET能力)的EAB生物膜成熟时间约为8000分钟(约 5.5天)，而能够检测水体硝态氮浓度(具有反向EET能力)的EAB生物膜成熟时间超过5000分钟(约3.5天)。因此，由于依赖成熟生物膜作为传感元件，MEB 使用前需要长达几周的启动和培养过程。然而，在复杂的实际使用环境中，对于 MEB所能够测量的指标(例如水体生化需氧量、水质生物毒性等)检测均存在着即时检测和应急检测的需求。因此，如何避免耗时的生物膜孵育过程、突破性地实现MEB即时检测，对于推动MEB实际应用具有重要意义。
[0006]生物膜是微生物所形成的有组织群体，其形成过程主要包括三个阶段。首先，处于悬浮状态下的微生物利用鞭毛等部件，从液相或者气相中迁移至固相载体表面，这称之为定殖阶段；当微生物迁移在载体表面后，微生物与载体的接触能够直接刺激微生物快速表达与胞外聚合物合成、分泌相关的通路，通过分泌大量的蛋白、多糖等物质提高微生物胞体与载体的结合力，即吸附阶段；最后，微生物通过生长增殖，形成具有一定厚度和致密程度的三维复杂且高度有序结构，达到生物膜的成熟阶段。传统MEB技术均基于EAB成熟生物膜，这主要是由于在尚未形成成熟生物膜的条件下，EAB可能不能产生电信号。例如此前基于混菌的研究发现，混菌EAB生物膜在成熟阶段产电量超过400mV，但其生物膜早期阶段产电量仅为1mV。有趣的是，专利技术人近期通过实验发现，模式EAB菌株洛伊希瓦氏菌(Shewanella loihica)PV
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4可以通过外膜具有氧化还原活性的细胞色素c等物质，当吸附在电极表面后即能够完成胞外电子传递过程，展现出明显的电化学活性。
[0007]因此，为了克服传统MEB依赖成熟生物膜的实际应用瓶颈，解决MEB无法即时检测的问题，本专利技术报道了采用吸附态洛伊希瓦氏菌(Shewanella lo本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种基于吸附态洛伊希瓦氏菌(Shewanella loihica)PV
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4实现微生物电化学传感器即时检测的方法，其特征在于：当洛伊希瓦氏菌(Shewanella loihica)PV
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4吸附在电极表面后，即洛伊希瓦氏菌(Shewanella loihica)PV
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4处于生物膜早期阶段，具有明显的电化学活性和产生生物电信号的能力，以具有正向和反向胞外电子传递能力的电化学活性微生物洛伊希瓦氏菌(Shewanella loihica)PV
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4为核心，将洛伊希瓦氏菌(Shewanella loihica)PV
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4菌体快速吸附在多孔电极表面，在不需要孵育成熟生物膜的条件下，构建微生物电化学传感器；将吸附态的所述洛伊希瓦氏菌(Shewanella loihica)PV
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4构建的所述微生物电化学传感器中加入样本，所述洛伊希瓦氏菌(Shewanella loihica)PV
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4产生生物电信号，随后检测生物电信号强度变化，进而实现微生物电化学传感器对样本的指定指标的即时检测；所述样本的指定指标包括氧化三甲胺或富马酸或水质生物毒性或生化需氧量。2.如权利要求1所述的一种基于吸附态洛伊希瓦氏菌(Shewanella loihica)PV
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4实现微生物电化学传感器即时检测的方法，其特征在于：所述多孔电极包括碳纤维布、碳纤维纸、碳纤维毡、石墨毡、活性炭、玻璃纤维，利用多孔电极比表面积大、强吸附性的特性，实现将洛伊希瓦氏菌(Shewanella loihica)PV
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4菌体快速吸附在多孔电极表面。3.如权利要求1所述的一种基于吸附态洛伊希瓦氏菌(Shewanella loihica)PV
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4实现微生物电化学传感器即时检测的方法，其特征在于：所述洛伊希瓦氏菌(Shewanella loihica)PV
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4菌体，其处于对数生长期或稳定期，菌悬液在600nm处吸光度在0.5
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2.0范围内。4.如权利要求1所述的一种基于吸附态洛伊希瓦氏菌(Shewanella loihica)PV
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4实现微生物电化学传感器即时检测的方法，其特征在于：所述的微生物电化学传感器，包括工作电极、对电极和参比电极，其中工作电极为吸附有洛伊希瓦氏菌(Shewanella loihica)PV
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4的碳纤维布，碳纤...

【专利技术属性】
技术研发人员：易越，罗霖，罗爱芹，梁阿新，毛执鹏，
申请(专利权)人：北京理工大学，
类型：发明
国别省市：