一种脂肪酸延长酶基因在酵母合成神经酸中的应用制造技术

本发明专利技术提供了一种脂肪酸延长酶基因在酵母合成神经酸中的应用。具体地，本发明专利技术提供了一种用于生产神经酸的工程菌，所述工程菌的基因组中整合有基因表达盒，所述的基因表达盒表达3

【技术实现步骤摘要】
一种脂肪酸延长酶基因在酵母合成神经酸中的应用


[0001]本专利技术涉及生物
，更具体地涉及一种脂肪酸延长酶基因在酵母合成神经酸中的应用。

技术介绍

[0002]神经酸(cis-15-Tetracosenoic acid,24:1Δ15)是一种超长链单不饱和脂肪酸(very long chain monounsaturated fatty acids,VLCMFAs)，主要以鞘糖脂和鞘磷脂的形式存在于动物大脑白质和髓鞘的神经纤维中，是生物膜的重要组成成分。神经酸在医学和保健方面具有重要的作用，具有促进大脑发育、改善记忆、调节血脂、增强免疫等功效，可用于治疗多发性硬化症等神经紊乱病症。此外，研究表明神经酸对神经系统的发育具有促进作用，尤其是在婴幼儿脑神经细胞和视神经细胞生长与发育过程具有重要的作用。
[0003]目前，木蜡酸(C24:0)、神经酸等超长链脂肪酸的合成在植物中认识较为清楚。植物以油酸为底物，通过超长链脂肪酸链延长循环进行碳链的延长，每次循环能够使原有脂肪酸的碳链延长两个碳原子。这个延长过程受4个酶(KCS、KCR、HCD和ECR)形成的酶复合体的组合催化和调控，目前普遍认为其中的KCS(3－酮酯酰－CoA合酶)是决定植物组织中超长链脂肪酸链长和合成速率的关键酶。
[0004]虽然神经酸用途广泛，对人体健康十分有益，但难以通过人体自身合成，需要从外界摄取。目前通过化学方法合成神经酸，因副产物多、工艺路线长、得率低，价格超过1000美元每公斤，不具有市场竞争力。神经酸市场需求巨大，但植物作为主要来源因生长缓慢，生长环境要求高等特点限制了神经酸的产量，通过微生物生产神经酸具有广阔前景。然而，已知的产神经酸微生物大部分具有致病性或者生产潜力不足，导致不能应用于工业化生产。
[0005]因此，本领域迫切想要开发一种能够高产神经酸的新方法。

技术实现思路

[0006]本专利技术的目的在于提供一种能够高产神经酸的新方法。
[0007]在本专利技术的第一方面，提供了一种用于生产神经酸的工程菌，所述工程菌的基因组中整合有基因表达盒，所述的基因表达盒表达3-酮酯酰-CoA合酶(KCS)基因所编码的蛋白。
[0008]在另一优选例中，所述工程菌包括酵母菌。
[0009]在另一优选例中，所述工程菌选自下组：解脂耶氏酵母、酿酒酵母、甲醇酵母、毕赤酵母、汉逊酵母、克鲁维酵母、假丝酵母、隐球酵母、东方伊萨酵母、红酵母、或其组合。
[0010]在另一优选例中，所述3-酮酯酰-CoA合酶基因来源于蒜头果(Malania oleifera)、碎米芥(Cardamine graeca)、元宝枫(Acer truncatum)、银扇草(Lunaria annua)、海檀木(Ximenia caffra)、旱金莲(Tropaeolum speciosum)、文冠果(Xanthoceras sorbifolia)、油菜(Brassica)、荠菜(Capsella)。
[0011]在另一优选例中，所述工程菌为解脂耶氏酵母(Yarrowia lipolytica)，较佳地，
为解脂耶氏酵母Yarrowia lipolytica Po1g-G3-MaoleKCS。
[0012]在另一优选例中，所述的基因组中整合有1-20个(较佳地，1-10个，更佳地，1-5个)所述的基因表达盒。
[0013]在另一优选例中，所述基因表达盒整合于选自下组的一种或多种启动子：TEF、TEFintro、EXP、GPD、GPAT、YAT。
[0014]在另一优选例中，所述3-酮酯酰-CoA合酶(KCS)基因为密码子优化的3-酮酯酰-CoA合酶(KCS)基因。
[0015]在另一优选例中，所述3-酮酯酰-CoA合酶(KCS)基因的序列如SEQ ID NO.1－11中的任一所示。
[0016]在另一优选例中，所述的3-酮酯酰-CoA合酶(KCS)基因受组成型或诱导型启动子的驱动。
[0017]在另一优选例中，所述的启动子选自下组：TEF、TEFintro、EXP、GPD、GPAT、YAT、或其组合。
[0018]在另一优选例中，所述的工程菌的神经酸的产量≥20g/L，较佳地，20－30g/L。
[0019]在另一优选例中，所述的工程菌的发酵生物量(细胞干重)≥120g/L，较佳地，130-200g/L。
[0020]在另一优选例中，所述的工程菌的神经酸/总脂肪酸(神经酸/总脂肪酸)的比例≥20％，较佳地，为20－65％，更佳地，25－65％。
[0021]本专利技术第二方面提供了一种生产神经酸的方法，包括步骤：
[0022](i)培养本专利技术第一方面所述的工程菌，从而获得含神经酸的发酵产物；和
[0023](ii)从所述发酵产物中分离出神经酸。
[0024]本专利技术第三方面提供了一种构建本专利技术第一方面所述工程菌的方法，包括步骤：
[0025](a)构建含有基因表达盒的载体，所述表达盒具有以下元件：筛选标记基因、抗性基因元件、rDNA同源重组基因片段，和目的基因，所述的目的基因为3-酮酯酰-CoA合酶(KCS)基因；
[0026](b)将步骤(a)获得的含有所述基因表达盒的载体转入受体菌株，获得受体基因组整合有所述基因表达盒的菌株。
[0027]在另一优选例中，还包括步骤(c)：PCR和DNA测序验证步骤(b)得到的整合有基因表达盒的菌株的基因型；和/或
[0028]步骤(d)：发酵检测得到的整合有基因表达盒菌株的神经酸的产量。
[0029]在另一优选例中，步骤(a)所述的载体为质粒、黏粒或核酸片段。
[0030]在另一优选例中，步骤(a)所述的表达盒还含有强启动子元件。
[0031]在另一优选例中，所述的强启动子元件包括TEFintro、GPAT、EXP、GPD。
[0032]在另一优选例中，所述的强启动子元件为TEFintro。
[0033]在另一优选例中，所述强启动子元件为1-3个，较佳地，1-2个，更佳地，为2个。
[0034]在另一优选例中，所述筛选标记基因选自下组：URA、leu、HGR、或其组合。
[0035]在另一优选例中，所述抗性基因元件包括氨苄抗性基因。
[0036]在另一优选例中，步骤(a)所述的表达盒具有以下元件：强启动子元件TEFintro、目的基因3-酮酯酰-CoA合酶(KCS)基因、包含URA、leu或HGR中的一种或多种的酵母筛选标
记基因、和氨苄抗性基因AMP。
[0037]在另一优选例中，步骤(b)所述受体基因组整合的基因表达盒的数量为1-5个，较佳地为1-3个。
[0038]本专利技术第四方面提供了一种本专利技术第一方面所述工程菌株的用途，所述工程菌被用作发酵生产神经酸的菌株。
[0039]应理解，在本专利技术范围内中，本专利技术的上述各技术特征和在下文(如实施例)中具体描述的各技术特征之间都本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种用于生产神经酸的工程菌，其特征在于，所述工程菌的基因组中整合有基因表达盒，所述的基因表达盒表达3-酮酯酰-CoA合酶(KCS)基因所编码的蛋白。2.如权利要求1所述的工程菌，其特征在于，所述工程菌包括酵母菌。3.如权利要求1所述的工程菌，其特征在于，所述工程菌选自下组：解脂耶氏酵母、酿酒酵母、甲醇酵母、毕赤酵母、汉逊酵母、克鲁维酵母、假丝酵母、隐球酵母、东方伊萨酵母、红酵母、或其组合。4.如权利要求1所述的工程菌，其特征在于，所述3-酮酯酰-CoA合酶基因来源于蒜头果(Malania oleifera)、碎米芥(Cardamine graeca)、元宝枫(Acer truncatum)、银扇草(Lunaria annua)、海檀木(Ximenia caffra)、旱金莲(Tropaeolum speciosum)、文冠果(Xanthoceras sorbifolia)、油菜(Brassica)、荠菜(Capsella)。5.如权利要求1所述的工程菌，其特征在于，所述工程菌为解脂耶氏酵母(Yarrowia lipolytica)，较佳...

【专利技术属性】
技术研发人员：王士安，韩兴丰，阮建昌，苏航，史鹏辉，樊伟明，李福利，
申请(专利权)人：浙江震元制药有限公司，
类型：发明
国别省市：