一种制备重组人奥克纤溶酶的方法技术

本发明专利技术提供了一种制备重组人奥克纤溶酶的方法，属于生物医药技术领域。该方法包括以下步骤：(1)制备酶切后的葡激酶：取重组葡激酶进行酶切，将酶切物分离纯化，得到酶切后的葡激酶；其中，酶切后的葡激酶的氨基酸序列如SEQ ID NO：3所示；(2)制备重组纤溶酶：在重组纤溶酶原中加入酶切后的葡激酶进行酶切，将酶切物分离纯化，得到重组纤溶酶。本发明专利技术首次发现利用上述方法能够有效去除重组纤溶酶中的杂质A，提高了重组克纤溶酶的纯度，排除了药品在临床应用中潜在的稳定性和安全性风险。本发明专利技术的方法成本较低，操作简单，适合工业化生产。适合工业化生产。适合工业化生产。

【技术实现步骤摘要】
一种制备重组人奥克纤溶酶的方法


[0001]本专利技术属于生物医药
，具体涉及一种制备重组人奥克纤溶酶的方法。

技术介绍

[0002]人体内的血栓常引发严重的心血管疾病，此类疾病发病突然，死亡率极高，溶栓治疗是治疗此类疾病的常用手段。人纤溶酶原是人体纤溶系统的关键成份之一。利用纤溶酶原激活剂将人纤溶酶原活化后得到的纤溶酶具有丝氨酸蛋白酶活性，能够降解包括层粘连蛋白、纤连蛋白和胶原蛋白等在内的多种蛋白。研究发现，纤溶酶能够通过水解玻璃体后膜和视网膜基底膜之间的粘附分子，使玻璃体和视网膜分离，达到治疗玻璃体黄斑粘连和黄斑牵引的目的。
[0003]人纤溶酶由791个氨基酸组成，分子量约为88kD，形成两条链，重链和轻链之间以二硫键连接。人奥克纤溶酶(Ocriplasmin)作为只保留酶活性片段的重组丝氨酸蛋白酶类的纤溶酶，能够通过诱导玻璃体液化及减弱玻璃体黄斑粘连，起到药物性玻璃体后脱离的作用，避免了手术完成玻璃体后脱离创伤大、脱离不彻底等缺陷。重组人奥克纤溶酶具有纤溶酶的蛋白水解催化活性，并且比人纤溶酶更加稳定。
[0004]目前微生物发酵后进一步活化是制备重组纤溶酶的主要方法。该方法先由毕赤酵母工程菌发酵得到不具活性的重组纤溶酶原，然后利用纤溶酶原活化剂进行酶切反应，获得具有活性的重组纤溶酶。常见的纤溶酶原活化剂有链激酶、葡激酶和尿激酶。其中，与链激酶、尿激酶相比，葡激酶由于具有更高的特异性而被广泛使用。天然的葡激酶(Staphylokinase，SAK)是金黄色葡萄球菌溶原性噬菌体合成的一种单链蛋白，由136个氨基酸组成，分子量15.5kDa。但是天然的葡激酶非常稀有，制备成本很高，为了降低生产成本，目前工业上主要采用重组葡激酶作为纤溶酶原活化剂来制备纤溶酶。
[0005]申请号为201911398263.1的中国专利申请报道了一种重组人奥克纤溶酶的制备方法，该方法包括以下步骤：(a)提供重组人纤溶酶原溶液；(b)将所述重组人奥克纤溶酶原溶液通过阳离子层析柱，得含有重组人奥克纤溶酶原的洗脱液；(c)将氨甲环酸加入所述洗脱液，并加入重组葡激酶进行酶切反应，得初级酶切液；和(d)将所述初级酶切液通过疏水层析柱，得到纯化后的重组人奥克纤溶酶溶液。该方法容易操作，纯化步骤简单，产物收率较高。但是，专利技术人在进一步的研究中发现，利用该方法获得的重组人奥克纤溶酶在RP
‑
HPLC图谱上产生了一个杂质(命名为杂质A)。
[0006]在药品开发中，杂质是否能被全面准确地控制，直接关系到药品的质量可控性与安全性。在药物的研究、生产和临床使用方面，必须严格控制杂质的种类和含量。为了提高重组人奥克纤溶酶产品的纯度，减少药物在临床应用中的安全性和稳定性风险，需要开发出一种制备不含上述杂质A的重组纤溶酶的方法。

技术实现思路

[0007]本专利技术的目的在于提供一种制备不含杂质A的重组纤溶酶的方法。
[0008]本专利技术提供了一种制备重组纤溶酶的方法，所述方法包括以下步骤：
[0009](1)制备酶切后的葡激酶：
[0010]取重组葡激酶进行酶切，将酶切物分离纯化，得到酶切后的葡激酶；其中，酶切后的葡激酶的氨基酸序列如SEQ ID NO：3所示；
[0011](2)制备重组纤溶酶：
[0012]在重组纤溶酶原中加入酶切后的葡激酶进行酶切，将酶切物分离纯化，得到重组纤溶酶。
[0013]进一步地，步骤(1)中，所述重组葡激酶的氨基酸序列如SEQ ID NO：2所示。
[0014]进一步地，步骤(1)中，所述酶切时采用的酶切试剂为肠激酶，酶切的温度为20～26℃，时间为14～20小时。
[0015]进一步地，步骤(1)中，所述分离纯化的方法为：
[0016](1.1)将酶切物上样到NI亲和层析柱，用平衡缓冲液冲洗，收集含有酶切后的葡激酶的流穿液；
[0017]其中，NI亲和层析柱的填料为NI Bestarose 6FF；
[0018]平衡缓冲液为pH＝5.5的50mM碳酸盐缓冲液；
[0019](1.2)将步骤(1.1)收集的流穿液上样到阳离子层析柱，用洗脱剂洗脱，收集含有酶切后的葡激酶的洗脱液；
[0020]其中，阳离子层析柱的填料为UniGel 50SP；
[0021]洗脱的方式为梯度洗脱；
[0022]洗脱剂由缓冲液A和缓冲液B组成，其中缓冲液B的浓度从0％增加到100％；缓冲液A为10mM碳酸盐缓冲液，pH＝5.5；缓冲液B为含10mM碳酸盐和0.5M NaCl的溶液，pH＝5.5；
[0023](1.3)将步骤(1.2)收集的洗脱液上样到混合模式层析柱，用平衡缓冲液冲洗，收集含有酶切后的葡激酶的流穿液；
[0024]其中，混合模式层析柱的填料为Bestarose Diamond MIX
‑
A；
[0025]平衡缓冲液为pH＝5.4的10mM碳酸盐缓冲液。
[0026]进一步地，步骤(2)中，所述重组纤溶酶原与酶切后的葡激酶的质量比为1:(100～140)；所述酶切的温度为20～26℃，时间为2～6小时。
[0027]进一步地，步骤(2)中，所述分离纯化的方法为：将酶切物上样到疏水层析柱，用洗脱剂洗脱，收集含有重组纤溶酶的洗脱液；
[0028]其中，疏水层析柱的填料为Capto Butyl Impress GE；
[0029]洗脱剂为20％～50％的缓冲液X，洗脱剂中缓冲液X的浓度从20％增加到50％；
[0030]缓冲液X为含20mM磷酸盐和0.2M氨甲环酸的溶液。
[0031]进一步地，步骤(2)中，所述重组纤溶酶原为重组人奥克纤溶酶原，所述重组人奥克纤溶酶原具有如SEQ ID NO：1所示的N端氨基酸序列。
[0032]进一步地，步骤(2)中，所述重组纤溶酶原是按照以下方法制得的：
[0033](a)种子活化与扩增：将表达重组纤溶酶原的毕赤酵母工程菌活化，扩增，得到种子液；
[0034](b)发酵：将步骤(1)的种子液接种至发酵培养基，进行发酵培养，当发酵液中细胞湿重大于等于180g/L，同时溶解氧大于等于100％时，加入诱导剂进行诱导，同时加入由质
量比为1：(1～4)的酵母粉和蛋白胨组成的氮源，诱导表达35～75小时，终止发酵；
[0035](c)收集发酵上清，分离提纯得到重组纤溶酶原。
[0036]进一步地，步骤(a)中，所述种子液OD
600
值为5.0～15.0；
[0037]进一步地，步骤(b)中，所述诱导剂为甲醇，甲醇的加入量为发酵培养基体积的40
‑
74％；所述氮源由质量比为1：2的酵母粉和蛋白胨组成；所述氮源的加入量为发酵培养基体积的2.5
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4.25％；所述诱导表达的时间为52～54小时。
[0038]进一步地，步骤(b)中，在加入诱导剂的同时还加入了终浓度为0.0本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种制备重组纤溶酶的方法，其特征在于：所述方法包括以下步骤：(1)制备酶切后的葡激酶：取重组葡激酶进行酶切，将酶切物分离纯化，得到酶切后的葡激酶；其中，酶切后的葡激酶的氨基酸序列如SEQ ID NO：3所示；(2)制备重组纤溶酶：在重组纤溶酶原中加入酶切后的葡激酶进行酶切，将酶切物分离纯化，得到重组纤溶酶。2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于：步骤(1)中，所述重组葡激酶的氨基酸序列如SEQ ID NO：2所示。3.根据权利要求2所述的方法，其特征在于：步骤(1)中，所述酶切时采用的酶切试剂为肠激酶，酶切的温度为20～26℃，时间为14～20小时。4.根据权利要求1所述的方法，其特征在于：步骤(1)中，所述分离纯化的方法为：(1.1)将酶切物上样到NI亲和层析柱，用平衡缓冲液冲洗，收集含有酶切后的葡激酶的流穿液；其中，NI亲和层析柱的填料为NI Bestarose 6FF；平衡缓冲液为pH＝5.5的50mM碳酸盐缓冲液；(1.2)将步骤(1.1)收集的流穿液上样到阳离子层析柱，用洗脱剂洗脱，收集含有酶切后的葡激酶的洗脱液；其中，阳离子层析柱的填料为UniGel 50SP；洗脱的方式为梯度洗脱；洗脱剂由缓冲液A和缓冲液B组成，其中缓冲液B的浓度从0％增加到100％；缓冲液A为10mM碳酸盐缓冲液，pH＝5.5；缓冲液B为含10mM碳酸盐和0.5M NaCl的溶液，pH＝5.5；(1.3)将步骤(1.2)收集的洗脱液上样到混合模式层析柱，用平衡缓冲液冲洗，收集含有酶切后的葡激酶的流穿液；其中，混合模式层析柱的填料为Bestarose Diamond MIX
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A；平衡缓冲液为pH＝5.4的10mM碳酸盐缓冲液。5.根据权利要求1所述的方法，其特征在于：步骤(2)中，所述重组纤溶酶原与酶切后的葡激酶的质量比为1:(100～140)；所述酶切的温度为20～26℃，时间为2...

【专利技术属性】
技术研发人员：彭红卫，李宁，
申请(专利权)人：上海景泽生物技术有限公司成都景泽生物制药有限公司，
类型：发明
国别省市：